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RT-PCR方法测定mdr1/mRNA表达

发布时间:2017-03-11 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1279

反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是检测mdr1/mRNA方法中最敏感并能定量的方法。先建立一含有模板mRNA随机引物oligo(dt)的反应体系,在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下,体外合成cDNA第一链,然后,再以这一反应合成的cDNA为模板,在mdr,特异性引物存在的另一反应体系中,经依赖于DNA的DNA聚合酶的酶促合成反应。该反应经过变性、退火和延伸三步的多次循环,使模板上介于两个特异性引物之间的靶序列不断得到扩增,可在短时间内获得百万个特异DNA的拷贝。PCR产物经电泳、染色后,根据内参照基因特异性电泳带光密度,可以直接估计或测定计算mdr1/mRNA表达水平。

1.材料

(1)细胞:待检的肿瘤细胞。

(2)试剂:RT-PCR试剂盒、焦碳酸二乙酯( diethyl pyrocarbonate,DEPC)、无菌三蒸水等。

(3)器具:PCR仪、紫外分光光度计、高速低温离心机、电泳槽、电泳仪、紫外透射仪、数码相机、凝胶电泳图像记录分析系统等。

2.方法

(1)异硫氰酸胍-步法提取细胞总RNA;

1)离心收集细胞(1X107~1x108个/ml) , PBS洗2次。

2)加入下列RNA抽提液:①500 ul变性液(4mol/L异硫氰酸胍,42mmol/L枸橼酸钠,0.5%十二烷基肌氨酸钠,0.2mmo1/L β-巯基乙醇),摇匀;②50ul醋酸钠(2mo1/L, pH 7.4),摇匀;③500ul水饱和酚,摇匀;④200ul氯仿/异戊醇(49:1),摇匀;置冰上20分钟;

3) 4℃ ,12 000r/min离心10分钟;

4)小心收集上层水相,转移到一个新的离心管中;

5)加500ul异丙醇,混匀,-20℃沉淀30分钟;

6) 4℃,12 000r/min离心20分钟;

7)用75%乙醇/DEPC水洗涤RNA沉淀2次,自然干燥10分钟,加适量DEPC水溶解RNA。

(2) P-gp在mRNA水平的表达:取5ul RNA溶液稀释30倍,于紫外分光光度计上测出该溶液的A260以及A280的数值,按下列公式计算RNA的浓度及纯度。其余RNA-70℃冰箱中保存备用。

RNA浓度:RNA (ug/ml)=A260x40x稀释倍数

RNA纯度:A260/A280比值在1.8~2.0之间为好

(3) PCR引物的设计与合成

mdrl:(Forward primer)5'CCCATCATTGCAATAGCAGG3’

(Reverse primer)5’GTTCAAACTTTCGCTCCTGA3’

β2微球蛋白:(Forward primer)5' ACCCCCACTGAAAAAGATGA3'

(Reverse primer)5’ATCTI'CAAACCTCCATGATG3’

(4) cDNA合成:反转录反应体系为20ul,包括2ug RNA, 4u1 MgC12 (25 mM),2 ul 10 xRNA PCR Buffer, 2 u1 dNTP (10mM),0.5 u1 RNA酶抑制剂(40U/ul),1ul反转录酶(5U/ul),1ul Oligo dT(2.5pmol/ul),以经过处理的没有RNA酶的三蒸水补足反应体系。反转录反应条件为:30℃ ,10分钟;55℃ ,30分钟;99℃ ,5分钟;5℃ ,5分钟。

(5) PCR扩增反应:PCR反应体系为50 ul,包括10ul上述反转录产物,另加MgC12 3 u1,10xPCR Buffer 4u1,Taq 0.25u1(5U/ul),目的基因上游引物和下游引物各0.5 u1,无菌三蒸水补足反应体系。

反应条件为:94℃变性30秒,55℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,通常扩增30循环。

(6) PCR产物电泳观察和半定量分析:PCR扩增结束后,取6u1 PCR产物在含EB(20mg/ml)的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,70V,40分钟,以DL2000为分子量Marker,电泳结果在紫外透射仪下以数码相机照相,用凝胶电泳图像记录分析系统记录结果。

【结果分析】

计算各电泳条带的灰度值,以目的基因条带和内参照β2微球蛋白基因条带的强度(灰度值)之比伽mdr1/(β2微球蛋白)为目的基因mRNA表达的相对值,据此相对值,即可以判断样品中mdr1 mRNA表达程度。

【注意事项】

1.整个过程中应绝对避免外源RNA酶的介入,操作者应戴手套,Tip枪头、Eppendorf管为新购未用的。塑料制品应用0.1% DEPC水处理,玻璃制品应在180℃干烤2小时。

2.每次加溶液时注意摇匀。

3.在反转录反应前,RNA必须经65℃变性处理,否则影响反应结果。

4.可靠的内参照能确保高质量的mRNA进行扩增。

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