病毒定量研究是利用细胞培养技术增殖病毒并测定病毒含量，也是对病毒感染性的测定。对病毒感染性的研究，也必须以细胞培养法为基础。测定病毒感染性强弱常用的方法有两种，一是TCID₅₀组织细胞感染量测定法，二是蚀斑形成法。

（一）TCID50病毒感染性测定法

50％组织细胞培养感染量（50% tissue culture infectious dose,TCID50）测定法是测定病毒感染培养细胞后，引起50％细胞发生感染的最小病毒量。一般是将病毒10倍系列稀释后，分别接种于细胞，经一定时间后观察细胞病变、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50％细胞的病毒量为终点，统计学方法计算出50％组织细胞感染量（TCID₅₀)。该方法是用半数感染量估计病毒感染性的强弱及含量，但不能准确测定感染性病毒颗粒的数量。这里介绍微量培养法测定TCID₅₀。

【材料】

1．待测病毒液麻疹病毒。

2．细胞Vero细胞。

3．培养液含10% FCS的MEM或RPMI 1640生长液及含2% FCS的MEM或RPMI 1640维持液。

4．消化液0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 1：1混合液。

5. 96孔组织培养板及微量移液器、吸管、试管等。

【方法】

1．选择经24～48小时培养生长旺盛、成层良好的Vero细胞一瓶，倾弃生长液，加入消化液5m1,37℃消化10～15分钟后，弃去消化液，加适量含10% FCS的MEM或RPMI 1640生长液分散细胞，使细胞悬液浓度为4x10⁵/ml。用微量移液器将细胞悬液加入无菌％孔培养板中，每孔0.1 ml。

2．将培养板置于37℃,5% CO₂孵箱中培养12～18小时，使细胞生长成单层。

3．将待测病毒液在试管内用含2% FCS的MEM或RPMI 1640维持液作10倍系列稀释，使病毒液浓度分别为10^-1,10^-2,10^-3 ......10^-8。稀释方法见表8-2。

4．弃去培养板中的生长液，各孔细胞用Hanks液洗涤2次，每孔加入不同稀释度的病毒液0.1ml，每个稀释度4个孔。4个对照孔加入维持液0.1m1,37℃吸附1小时，然后各孔再加入维持液0.1ml，轻轻摇匀，37℃,5% CO₂下静止培养。倒置显微镜下逐日观察各孔细胞病变，连续观察4天。

【结果】

细胞100％出现CPE判为（4+);50％～75％细胞出现CPE为（3+) ;25％～50％细胞CPE为（2+) ;25％以内细胞CPE为（+）；无CPE为（-）。

凡能使50％的细胞出现CPE的最高病毒稀释度，即为50％组织培养感染量（TCID5O)。TCID₅₀的计算通常按Reed-Munch计算法（表8-3）进行，举例如下：

表中10^-5的病变孔累积阳性百分率高于50%，而10^-6的阳性百分率低于50%,50％阳性率终点分布于两者之间，计算公式为：

高于50％感染百分数的病毒稀释度的对数（即1g10^-5）为-5.0，故TCID₅₀=5.0+0.2=5.2（即10^-5.2），也就是说，此病毒的10^-5.2的浓度，以0.1 ml接种细胞孔后，即有50％细胞病变的可能性。故该病毒TCID₅₀=10^-5.2/0.1 ml。

（二）病毒蚀斑形成试验

蚀斑形成试验（plaque forming assay）是目前测定病毒感染性最精确的方法之一，可以测得活病毒颗粒数。该方法是Dulbecc。和Vogt于1954年创建的。原理是将一定稀释度的病毒悬液加入到单层细胞培养瓶中，吸附一定时间后再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养层中不易扩散。结果每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶，此即蚀斑。用中性红染色，活细胞着色，而感染灶中的死细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑。每个蚀斑是由一个有感染性活病毒颗粒复制而形成的，故称为蚀斑形成单位（plaque forming unit,PFU )，病毒悬液中含有的感染性病毒量，以每毫升的空斑形成单位来表示，即PFU/ml。

【材料】

1.待测病毒液麻疹病毒约106TCID₅₀/ml。

2．细胞 Vero细胞单层培养平皿（60mm）或单层细胞培养瓶18支。

3．含2% FCS的MEM（或RPMI 1640）维持液、Hanks液。

4. 1.5％琼脂覆盖培养基

A液（50ml):10xMEM（不含酚磺酞)9.5ml,FCS 5.0m1,7.5% NaHC0₃ 2.9ml及灭菌蒸馏水32.6ml，无菌配制，置37℃水浴箱预温。

B液（50ml)：琼脂1.5g溶于50.0ml蒸馏水中。121℃高压灭菌15分钟后，置56℃水浴箱中预温。

A,B混合液：A液、B液等量混合，现用现配，保温42℃左右待用。

5. 1％中性红琼脂培养基（C液）:10xMEM 5m1、琼脂0.75g,1％中性红及44ml去离子水，121℃高压灭菌15分钟，50℃水浴预温，用前加7.5% NaHC0₃ 1.5m1。

【方法】

1．病毒的稀释与接种取9支小试管，将待检病毒用维持液10倍系列稀释，从10^-5之后加半log稀释到10^-7，具体方法见表8-4。

将培养24小时的单层细胞各平皿（或培养瓶）内生长液弃掉，将病毒液接种于细胞上。按不同倍数稀释的病毒液10^-7、10^-6.5、10^-6、10^-5.5、10^-5和维持液对照等6组接种，每组设3支平皿（或培养瓶），每皿（瓶）接种0.5 ml，充分铺满并吸附1小时。每巧分钟摇动1次使之均匀地接触细胞。

2.覆盖琼脂培养基将42℃预温的覆盖培养基（A,B液等量混合）迅速吸取4～5 ml加入各细胞培养皿（或瓶）中铺盖于已接种病毒的单层细胞表面，待琼脂凝固后，将琼脂层向上，置37℃培养3～4天并显微镜下逐日观察。

3．染色并计数空斑培养第4天向各培养皿（瓶）中加50℃预温的1%中性红琼脂培养基（C液）2ml，待凝固后，置37℃孵箱内培养数小时（或过夜）后，肉眼或镜下计数空斑。由于中性红可使活细胞着色，病毒感染灶则形成无色空斑。

【结果判定】

计数时选择空斑不融合、分散呈单个、数目在30～100个／皿（瓶）的培养器，分别计算各病毒稀释度的空斑数，并求3瓶平均值，按下列公式计算。

【注意事项】

1．将病毒液不同倍数稀释后，各管要混匀，使感染病毒的培养细胞能出现可数而不密集的空斑，便于准确计算。

2.覆盖琼脂培养基要维持在42℃左右，不能过凉和过热，过凉琼脂易凝，过热易使病毒失活。