体外培养的肿瘤细胞系的传代及日常维持过程中，在培养容器、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费；而且肿瘤细胞一旦离开活体开始体外培养，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外环境条件的改变而不断有新的变化。因此及时进行肿瘤细胞冻存十分必要。现在，肿瘤细胞低温冷冻储存已成为细胞培养室的常规工作和通用技术。细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。肿瘤细胞冻存及复苏的基本原则与常规细胞一样，是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。

（一）肿瘤细胞的冻存

冻存肿瘤细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化而引起细胞的死亡。在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前多采用甘油或二甲亚砜(DMSO）作保护剂。这两种物质在深低温冷冻后对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。

【材料】

(1)待冻存的肿瘤细胞。

(2）含10％～20％血清培养液、0.25％胰蛋白酶。

(3) DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（高压蒸气消毒后使用）。

(4）器具：玻璃吸管、离心管、2m1冻存管（一种专门用于冻存、瓶口带密封垫的塑料螺口小瓶，使用方便而且不易炸裂；但如质量不好，有时密封不严，因而使用前要仔细检查，或者高压蒸气消毒后再使用）。

（5）细胞冻存专用液氮罐。

【方法】

(1)从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换1次培养液。

(2）用0.25％胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，1000r/min离心5分钟。

(3）去除胰蛋白酶及原培养液，加入配制好的冻存培养液（含10% DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为（5～10)x10⁶/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每支冻存管加液1～1.5ml细胞悬液。

(4）冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间、实验操作人员姓名等信息。装入支架同时做好记录。

(5)封好的冻存管即可直接冻存。标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。要适当掌握降温速度。过快会影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。各种细胞对冷冻的耐受性不同，一般来说上皮细胞和成纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以不超过-2～-3℃/min合适；而胚胎细胞耐受性最小。总之，在开始时温度下降速度不能超过-10℃/min。要精确控制冷冻速度需要程序降温仪。目前还有一种简易的商品化的细胞冻存盒，内部充满异丙醇，将冻存管放置其中。把冻存盒放入-80℃冰箱中，可以实现-1℃/min的降温速率冻存细胞。

如无此设备一般可以采用以下几种冻存方法来控制冷冻速率。①首先将冻存管直立放置于塑料盒或小纸盒中，周围固定，以免倾倒。将安置好的小盒放入小型泡沫包装盒内，然后再放入-80℃冰箱中，尽可能减缓降温速率，经过3小时以后，取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要戴手套操作以免冻伤；②可以将标记好并装入冻存管支架，从液氮容器口缓缓放入，按1℃/min的降温速度，在30～40分钟时间内使其到达液氮表面。再停30分钟后，直接投入液氮中。

【注意事项】

液氮数量要定期检查，如发现液氮已挥发一半时要及时补充。补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位的防护，以免冻伤。为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏1次后，再继续冻存。

（二）肿瘤细胞的复苏

肿瘤细胞的复苏与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

【材料】

冻存细胞一支、培养液、移液器、离心管、培养瓶、带盖不锈钢罐。

【方法】

(1)从保存冻存管小袋内或支架上取出的冻存管直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容冻存细胞系尽快融化。

(2）从37℃水浴中取出冻存管，用乙醇消毒后开启，用移液器吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再重复用培养液洗1次。

(3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入培养箱静置培养，24小时更换1次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做10～20倍稀释，接种细胞密度以5x10⁵/ml为宜。

【注意事项】

如果冻存管封闭不严，在保存过程中液氮进入其中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，冻存管爆裂的碎片可伤害面部等身体部位。因此存取冻存管时要佩戴防护眼镜和手套，冻存管投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。