北京普天同创生物科技有限公司
骨髓间充质干细胞(mesechymal stem cell, MSCs)是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下,这类细胞可定向分化为各胚层来源组织,成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等。临床上MSCs可望应用于组织工程、细胞工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。
一、骨髓间充质干细胞的分离与培养
目前常用的分离MSc的方法有全骨髓法和密度梯度离心法,全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液以除去不贴壁细胞,逐渐纯化细胞,获得了细胞形态趋于一致、胞体饱满、以梭形为主、增殖迅速的干细胞作为实验细胞,是一种经济简单和有效的分离和纯化方法。密度梯度离心法根据骨髓中细胞成分比重的不同,利用Percoll分层液提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSc表面抗原认识的深入,有研究者利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化,获得大量骨髓间充质干细胞。
(一)全骨髓直接培养法
【材料】
1.组织来源18~45岁的健康人骨髓样本。
2.培养用试剂无钙镁PBS (CMF-PBS )
3.培养基配方和制备L-DMEM培养基含10% FBS,100lU/ml青霉素和l00lU/ml链霉素。
4.实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿,注射器。
【方法】
1.取材5 ml肝素化的骨髓标本加入10ml的L-DMEM培养基。
2.接种细胞以2x106/ml细胞浓度接种于培养板,于37℃,5% C02饱和湿度的培养箱中培养。48小时首次换液,换液时用PBS洗涤两次,7~10天传第一代,以后2~3天传代。
【结果】
全骨髓直接培养法得到的贴壁细胞形态多样,细胞成分多样,48~72小时后细胞呈纺锤形、长梭形、多角形,细胞增殖迅速,原代培养约5天左右可达到80%~90%融合。传2代后细胞较纯,5~7天内达到80%~90%融合,骨髓间充质干细胞呈典型的涡旋样排列(图6-2)。
【注意事项】
1.全骨髓培养法分离的骨髓间充质干细胞,早期细胞成分混杂,传2代后细胞较纯,细胞形态均一。
2.全骨髓培养法分离的骨髓间充质干细胞,操作简单、快速,骨髓需要量相对少,对细胞活性的影响小。
(二)密度梯度离心培养法
【材料】
1.组织来源18~45岁的健康人群骨髓。
2.培养用试剂
(1)PBS
(2) Percoll分层液(密度为1.037g/ml)
(3) 0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA混合消化液。
3.培养基配方和制备L-DMEM培养基含10% FBS, l001U/ml青霉素、l001U/ml链霉素。
4.实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、注射器、巴斯德吸管等。
【方法】
1.取材5 ml肝素化的骨髓标本加入10ml的PBS混匀。
2.消化1500r/min离心10分钟,弃上清液。
3.分离细胞洗涤后的细胞以PBS制成4x107/ml的悬液,取5 ml叠加5m1 Percoll分离液(1.073 g/ml)上,1500r/min离心10分钟,取单个核细胞层,PBS洗涤两次,以1x106/ml的密度接种于培养瓶中,加入L-DMEM培养基,置37℃,5% CO2的饱和湿度的孵箱中,48小时换液,以后每3~4天换液。
【结果】
密度梯度离心法分离得到的贴壁细胞呈圆形,48~72小时后呈纺锤形、梭形、多角形,增殖迅速,原代培养约7天左右可达到80%~90%融合。传代细胞24小时内完全贴壁,3~5天内达到80%~90%融合。
【注意事项】
1.细心分离单个核细胞层,获得骨髓间充质干细胞。
2.与全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞相比,密度梯度离心法获得的细胞纯度高。
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