造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）是从血液或骨髓中分离，造血干细胞具有高度的自我更新能力。在适当条件下，向多个方向分化为各系造血细胞，并具有长期处于非增殖状态的特性。造血干细胞的分化是一个造血细胞数量逐步放大的过程，这些细胞逐步的分化成熟，经由造血祖细胞到形态可辨认的前体细胞，最终成熟并逐渐走向死亡。人体生产和存储造血干细胞，大部分在骨髓里，称为骨髓造血干细胞，还有一部分在外周血液、脐带及胎盘中。
在造血组织中，造血干细胞与其他单个核细胞在形态学方面是很难区别开来的，由于造血干细胞的数量极少，这为造血干细胞的分离纯化并对其功能进行分析研究造成极大困难。近年来，由于单克隆抗体技术的进步及流式细胞仪（flow cytometer）的广泛应用，为造血细胞的分离纯化及鉴定创造了有利条件。

一、骨髓造血干细胞的分离与培养

造血干细胞的经典来源是骨髓。骨髓中大约100000个细胞中只有1个造血干细胞；其他成分为基质细胞、基质干细胞、祖细胞、成熟和正在成熟的白细胞和红细胞。

【材料】

1．组织来源18～45岁的健康人骨髓。

2．培养用试剂1％白蛋白盐水液。

3．培养基配方和制备IMDM培养液。

4．实验器材玻璃平皿、50m1和15m1离心管。

【方法】

1．取材抽取的患者骨髓液5 ml按4:1比例加入6%羟乙基淀粉（HES )，自然沉降红细胞后，分离上层液。

2．分离细胞在4℃下，以1500r/min离心10分钟，将细胞沉淀物用1％白蛋白盐水液洗涤细胞2次。

3．接种与培养将细胞以3 x 10⁶/ml密度接种于培养瓶中，加入IMDM培养基于37℃ 5% CO₂孵箱中培养，每3天换液。

【结果】

骨髓来源的造血干细胞悬浮于培养液中，胞体圆形，细胞核深染，培养3～4天，细胞集落形成，培养21天左右，细胞生长达到顶峰，随后细胞生长速度减慢。

【注意要点】

1．抽取骨髓时要避免混进血液。

2．骨髓供者年龄及身体状态直接影响造血干细胞的分离。

二、外周血干细胞的分离与培养

从外周血收集细胞比从骨髓中收集更容易：痛苦小，无需麻醉，并发症少，外周血收集的细胞中干细胞的含量比从骨髓中收集的高1倍。因此，外周血干细胞（peripheral blood stem cell, PBSC )，已在很大程度上代替骨髓，成为自体移植的最主要干细胞来源。在正常生理条件下，外周血的造血干细胞量极少，但对供体注射一种细胞因子，如粒细胞刺激因子（granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)，可加速骨髓造血干细胞的生成并释放到外周血中。一般在收集细胞前几天对供体注射G-CSF。收集时在静脉中插入导管，使血液通过分选系统，选出CD34+白细胞，让红细胞返回供体。在选出的细胞中大约有5% 20％是真正HSCs。事实上，骨髓中CD34+细胞是干细胞、祖细胞和各个成熟阶段白细胞的混合物。

【材料】

1．组织来源18～45岁的健康人静脉血。

2．培养用试剂

1％白蛋白盐水液。

3．培养基配方和制备IMDM培养液。

4．实验器材玻璃平皿、50m1和15m1离心管、血细胞分离机。

【方法】

1．取材经G-CSF动员的外周血，血细胞分离机离心使细胞分层。

2．接种细胞采集单个核细胞，将采集分离的单个核细胞按2 x 10⁶/ml密度接种至培养瓶内，加入培养基，37℃ ,5% CO₂条件下培养。

【结果】

倒置显微镜观察，分离的细胞悬浮生长，大小不一，培养3～4天，可见细胞集落形成。

【注意事项】

动员后的外周血可以提取干细胞培养，但细胞量少，常要使用集落刺激因子、生长因子等体外扩增造血干细胞。

三、脐带血干细胞

与骨髓和动员的外周血收集造血干细胞相比，脐带血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，脐带血成为造血干细胞的重要来源。

【材料】

1．组织来源正常足月产新生儿脐带血。

2．培养用试剂

（1）PBS。

（2) ACD2B血液保存液

3．培养基配方和制备IMDM培养基，添加20％的胎牛血清、50ng/ml人重组蛋白、20ng/ml干细胞因子（SCF),20ng/ml白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-3（IL-3),20ng/mlG-CSF,20ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)。

4．实验器材玻璃平皿，注射器。

【方法】

1．取材无菌采集正常足月产新生儿脐带血置于ACD2B血液保存液中，6～8小时内进行分离。

2．分离细胞新鲜脐血按4:1体积比加入60g/L的羟乙基淀粉，静置40～60分钟，去除沉淀的红细胞，收集富含有核细胞的血浆，PBS洗涤2次，Ficoll离心分离出单个核细胞。

3．接种与培养用IMDM培养液洗涤两次，以2x10⁵/ml细胞浓度接种于培养板，于37℃,5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

【结果】

培养2～3天，可见细胞集落形成，培养14天，集落细胞增殖达到顶峰，随后细胞生长速度减慢。

【注意事项】

1．收集到的脐血在6小时内进入分选程序。

2．脐血采集不同于传统的骨髓采集，不需要进行麻醉，无痛、无副作用。

四、胎盘造血干细胞

胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的8～10倍，可供小儿患者自用几次，还可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞移植能有效解决骨髓或动员后外周血来源不足等难题。

【材料】

1．组织来源足月分娩的人胎盘。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2) 0.25％胶原酶。

3．培养基配方和制备 RPM 1640培养基，荧光标记单克隆抗体CD38-FITC, CD34-PE。

4．实验器材 眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、不锈钢网、400目尼龙网、注射器。

【方法】

1．取材多点剪取胎盘组织，Hanks液漂洗3次，将其充分剪碎。

2．消化0.25％胶原酶消化20分钟，用不锈钢网过滤，细胞滤液1000r/min离心5分钟。

3．分离细胞细胞沉淀用100ml RPMI 1640混匀。胎盘单个细胞悬液按4:1的比例加入6%羟乙基淀粉（6% HES)，混匀，静置45分钟至红细胞完全沉降。吸取富含单个核细胞的上层液，按1:3的比例加入Hanks液，1000r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物用含15% FCS的RPMI 1640培养基悬浮，再按1.3的比例加入RBC裂解液，作用5分钟。1000 r/min离心5分钟，细胞沉淀物用含15% FCS的RPMI 1640洗涤、悬浮，经400目尼龙网过滤。

4．接种细胞以2x10⁶/ml细胞浓度接种于培养板，于37℃,5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

【结果】

分离的细胞悬浮生长，培养2～3天，可见大小不等的细胞集落形成，培养14天，可见集落内有80～100个细胞。

【注意事项】

1．收集到的胎盘在6小时内必须进入分选程序。

2．从胎盘组织可以获得高丰度、高富集度、高活性的造血干细胞。

五、造血干细胞的可塑性

近年来研究发现，HSC可分化成为在发育上无关的其他系列的细胞类型，即造血干细胞具有可塑性（plasticity )。通过细胞表面标志或细胞功能活性分离出HSC，注入动物模型后观察，证实HSC不仅能重建造血细胞，还可向非造血组织细胞分化，如可分化为皮肤表皮细胞、肺上皮细胞、肠上皮细胞、肾上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、神经元和视网膜色素上皮细胞等多种细胞。