小鼠胚胎干细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化的条件，来保持其高度未分化潜能。使用胚胎成纤维细胞作为饲养层培养ES细胞。培养的ES细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ES细胞最普遍使用而且有效的方法。

【材料】

1．组织来源孕鼠（12.5～15.5日龄），饲养层细胞STO细胞（SLN或STO/N/L细胞株）。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2）冲胚液：DMEM培养液，含10％牛血清（Calf serum, CS）和25 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid, HEPES) (pH 7.4)。

(3）消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液，用无钙镁PBS配制，pH 7.4。

3．培养基配方和制备

(1) ES培养液：DMEM培养液（高糖），含有15% CS,4.5g/L葡萄糖、2mmol/L谷氨酰胺、0.lmmol/L β-琉基乙醇,1 mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/L非必需氨基酸、10001U/mL LIF（用STO饲养层时不用LIF)。

(2）小鼠胚胎成纤维细胞培养液：低糖DMEM含有10％小牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材取受孕3.5天的小鼠脱颈断髓处死，剪开腹腔取出子宫角，冲胚液冲洗子宫角，收集胚胎。将小鼠囊胚随机放人铺有饲养层细胞STO的4孔培养板上，每孔1枚，每孔加ES培养液，置37℃,5% C0₂饱和湿度的培养箱中培养。培养4～5天后，无菌玻璃针拨动形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物，使其与滋养层细胞分离。

2．消化D-Hanks液洗细胞团2次，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞团5分钟，直至细胞团松散，离散成小细胞团块，脱离培养皿的底部。加ES培养液终止反应。

3．分离细胞将细胞悬液移人离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以3x10⁶个／ml密度接种至预先铺有饲养层细胞的培养板上，4孔培养板上，置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。如此每隔2～3天重新传代1次。凡不具分化表型的小鼠ICM集落再继续传代培养。

【结果】

以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养24～48小时后，胚胎从透明带中孵化出来，随着饲养层的移动而黏附到培养皿上。此时可清楚地辨别出内细胞团。分离隆起生长的胚胎内细胞团并继续培养，48小时后ICM迅速生长。培养4～5天后，ICM长成一簇簇的细胞团且未有分化现象，形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物，ES细胞集落的特征呈鸟巢状（图6-1）。

【注意事项】

1．饲养层在体外培养中分泌LIF，能明显促进ICM的增殖。

2．在分离和培养ES细胞的过程中饲养层的状态对ES的生长状态至关重要。