来源于早期胚胎的胚胎干细胞（ES）和胎儿生殖嵴干细胞（embryonic germ cells, EGCs)可在未分化状态下长期增殖培养，并保持其多向分化潜能。某些细胞因子和化学物质等可定向诱导ES细胞分化为各种不同类型的组织细胞。

一、鸡胚干细胞的培养与体外分化

鸡胚干细胞（chicken embryonic stem cells, CES Cells）来源于原始生殖细胞和内细胞团，经体外培养后仍具有无限增殖和分化全能性的细胞。鸡胚胎干细胞的体外培养，从X期胚盘分离的胚盘细胞或早期鸡胚的生殖峪分离的原始生殖细胞，采用饲养层细胞培养，维持细胞在培养过程中的未分化状态。鸡胚干细胞的培养在疾病的细胞替代治疗的研究中具有广泛的应用前景。

【材料】

1．组织来源孵化2天的鸡胚。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS(CMF-PBS)。

(2）消化液：0.25％胰酶。

3．培养基配方和制备鸡胚干细胞培养基：高糖DMEM含有10％胎牛血清、2％鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、5.5x10⁵mol/L β-巯基乙醇,10 ul/mL非必需氨基酸、10001U/ml白血病抑制因子（LIF) , lOng/ml碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和5 ng/ml干细胞生长因子（stem cell growth factor,SCF)。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材鸡胚孵育时，需要在每个新鲜种蛋上用铅笔标上开始孵育的时间，置于38.1℃恒温箱中孵育，选用孵化2天的鸡胚，眼科镊打孔，暴露X期胚盘，眼科剪小心分离。

2．分离细胞收集鸡胚，PBS漂洗2次。

3．消化0.25%胰酶，37℃消化5分钟，反复吹打，1000r/min离心8分钟，弃上清液，用鸡胚干细胞培养基重悬细胞。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以3x10⁶个／ml密度接种至鸡成纤维细胞制备的饲养层上，用添加了生长因子的鸡胚干细胞培养基培养细胞。置于37℃,5% C0₂孵箱中培养。

【结果】

可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。单个ES细胞体积较小，核大，具有一个或多个核仁。置于饲养层培养24小时出现小的细胞集落。48小时后集落明显增多，生长明显，隆起增大，呈典型ES细胞所特有的鸟巢状形态。随时间延长，集落进一步增大，边缘更清晰，传代24小时，细胞开始聚集，形成集落，但形状并不典型，培养2～3天，细胞开始增殖，形成克隆。

【注意事项】

胚盘的分离过程直接影响到鸡胚胎干细胞的分离与培养。