干细胞(stem cells, SC）是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）和成体干细胞（somatic stem cell)。干细胞系的建立，对研究基因在分化发育过程中的表达与调控，建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，以及制备人类疾病动物模型等研究具有重大意义。目前，小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟。

一、干细胞分离材料的获取与处理

根据干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。①胚胎干细胞(ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体的所有组织和器官。可由哺乳动物的囊胚内细胞群或者床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中分离获得。②成体干细胞是指存在于组织的特定区域内的未分化细胞，数量极少，在数年内都保持不分裂的状态，只有当组织受到损伤时才被激活，开始分裂。成体干细胞主要存在于脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏，成体干细胞在培养时间上有限制，并且只能分化为限定类型的几种细胞。成体干细胞表面有许多特殊标记，利用这些标记，采用荧光细胞分离器从细胞悬液中的分离纯化出成体干细胞。

二、干细胞的分化抑制培养

胚胎干细胞是从动物胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离的具有全能性的细胞，在遗传学、发育生物学和细胞工程领域具有广阔的应用前景。抑制胚胎干细胞分化和促进胚胎干细胞增殖是克隆胚胎干细胞的关键，添加白血病抑制因子（LIF）能有效提高胚胎干细胞克隆率、抑制干细胞的分化。

三、干细胞的生物学性状与鉴定

干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞也可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。

（一）干细胞的生物学性状

1．自我更新能力干细胞一旦形成，终生都具有自我更新能力，干细胞通过不均一分裂进行自我更新和产生分化祖细胞。

2．高增殖能力干细胞研究及应用的前提和关键是在体外能够大量扩增。如造血干细胞通过高度扩增，可补充由于细胞正常衰老死亡而丧失的血细胞。因此，干细胞高度扩增不但对干细胞的研究和应用有着重要的作用，而且对机体正常功能的维持也起着重要的作用。

（二）干细胞的鉴定方法主要包括以下几个方面

1．形态学鉴定干细胞体积小、核大、核质比高，一个或多个核仁，常染色质，胞质少、结构简单。细胞排列紧密，呈集落样生长。细胞克隆与周围界限明显，克隆内细胞间界限不清。

2．传代能力鉴定体外培养条件下，干细胞具有很强的增殖分化能力，可传数十代次依然保持未分化状态。

3．特异性标记物鉴定利用干细胞表面的特异性分子标记对干细胞进行鉴定。干细胞鉴定常用到的标志物有阶段特异胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen, SSEA )（SSEA-1,SSEA-3）、Oct3/4,SOX2,Nanog等。

4．分化能力鉴定ES细胞具有发育全能性，分化能力鉴定分为体内和体外两部分。

(1)体外分化实验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，贴壁生长的ES细胞会自发地分化为各种细胞。

(2)体内分化实验：将培养的ES细胞注入同源动物的皮下，一段时间后形成有三个胚层的细胞的畸胎瘤。

5．碱性磷酸酶(ALP )染色鉴定哺乳动物的桑套胚和早期囊胚碱性磷酸酶呈阳性，通过鉴定ES细胞碱性磷酸酶表达情况来确定ES细胞是否发生分化。

6．核型分析鉴定正常的ES细胞是二倍体核型，随着传代次数的增加及培养时间的延长二倍体核型会发生变化。因此要通过定期核型分析来检查所建立的ES细胞系。

四、干细胞系的建立与保存

胚胎干细胞系的建系方法已趋成熟，国内外建立了人和多种动物早期胚胎的ES细胞系。以人胚胎干细胞建系方法为例，干细胞系的建立。主要包括几个基本的过程：去除囊胚的透明带，再去除外围的滋养细胞层，直接机械法分离内细胞团，将完整的内细胞团接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，待细胞从内细胞团中爬出来，形成集落样结构，经过反复传代，建成胚胎细胞系。对建立的胚胎干细胞系进行形态学、传代能力及分化能力鉴定、特异性标记物鉴定、体内外分化能力鉴定。胚胎干细胞系通过超低温冷冻保存，使细胞的代谢活动完全停止，长期保存。

【材料】

1．组织来源 人体外受精的囊胚，小鼠MEF饲养层细胞。

2．培养用试剂

（1）D-Hanks液。

(2）消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液。

3．培养基配方和制备人胚胎干细胞培养液DMEM培养液（高糖）含有20％新生牛血清（Calf serum,CS),4.5g/L葡萄糖、2mmo/L谷氨酰胺、0.1 mmo/L β-巯基乙醇、0.1mmo/L非必需氨基酸。

4．实验器材1 ml注射器、玻璃平皿、50ml和15 ml离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材用人胚胎干细胞培养液漂洗囊胚2次，解剖显微镜下用1 ml注射器针头将内细胞团（inner cell mass, ICM）周围的滋养外胚层细胞去除，获取1CM，接种至小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。置37℃,5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。4～5天1CM扩增后，用无菌玻璃针拨动形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物，使其与滋养层细胞分离。接种到新的滋养层中过夜。

2．消化用0.25％胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞团5分钟，直至细胞团离散成小细胞团块，脱离培养皿的底部。加入ES培养液终止反应。

3．分离细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以3 x 10⁶/ml密度接种至预先铺有饲养层细胞的4孔培养板上，置37℃,5% C0₂饱和湿度的孵箱中培养。如此每隔2～3天重新传代1次。凡不具分化表型的小鼠ICM集落就再继续传代培养。

【结果】

单个ES细胞体积较小，核质比高。置于饲养层培养24小时后，出现小的细胞集落。48小时后集落数量增多，细胞生长旺盛，隆起增大，呈典型ES细胞所特有的鸟巢状形态。

【注意事项】

用囊胚期胚胎进行干细胞建系，确保细胞源于内细胞团，保证建立的细胞系具有分化全能性。