体外神经组织细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的一种技术手段。神经组织（nervous tissue）由神经元（neuron）和神经胶质细胞（neuroglia cell）组成。神经元是高度分化的细胞，在体外培养条件下很难增殖。目前神经元的培养主要用于原代培养。神经细胞培养需要极高的营养条件，对于底物的选择也比其他细胞苛刻，因此细胞培养皿需要经过特殊处理。神经细胞在未处理的塑料或玻璃上不能很好地存活，但在D-多聚赖氨酸或胶原蛋白内能向外长出轴突。神经胶质细胞分泌的因子和多肽神经因子促进轴突生长。

【材料】

l．组织来源脑肿瘤、脑外伤和顽固性癫痛手术切除的脑组织。

2．培养用试剂

（1）清洗液HBSS，添加200U/ml青霉素和200ug/ml链霉素。

(2）消化液0.05%胰蛋白酶。

3．培养基配方和制备

（1）接种培养液：DMEM，添加10% HS 0.lmmol/L丁二胺、60mg/L孕酮,33mmol/L葡萄糖、100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

(2）维持培养液：DMEM，添加15% FBS,10% HS 0.lmmol/L丁二胺、5mg/L胰岛素、60mg/L孕酮、10mmol/L丙酮酸钠、33 mmol/L葡萄糖、l00mg/L转铁蛋白、0.1％卵白蛋白、10ug/L NGF-β,100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、解剖剪和解剖镊,24孔培养板和盖玻片。

【方法】

1．取材

(1)培养皿铺底：用无离子的蒸馏水稀释硅胶液，使浓度达到0.1％～1%，将滴管浸入该溶液，或用溶液冲洗内面，空气中干燥24小时或100℃干燥数分钟，消毒。用蒸馏水溶解D-多聚赖氨酸，使浓度为l0mg/L,滤过除菌，给每一个3.5cm培养皿中加入1 ml的溶液，静置10～15分钟后除去溶液，加入适量培养液，将培养皿放入培养箱至少2小时，备用于接种细胞。

(2）取材：取脑组织，置于无菌培养皿内。然后，用预冷的HBSS冲洗脑组织3次。在解剖显微镜下，剥离软脑膜和血管，取皮质。将皮质脑组织剪成大小约1 mm³左右的小块。

2．消化将组织块放入0.05％的胰蛋白酶中，在37℃水浴中振荡消化30分钟。用吸管轻轻吹打，再用不锈钢网滤出组织块。

3．分离细胞用HBSS收集组织块，将组织块研碎后，用吸管反复吹打，制成细胞悬液。然后，移入15ml离心管中，室温条件下静置10分钟后弃上清液，重复冲洗细胞3次，每次洗后都让组织沉到管底。然后，向离心管内细胞沉淀中加入5 ml培养液，用吸管反复吹打，进行1000r/min离心10分钟。

4．接种与培养弃去上清液，用培养液悬浮沉淀细胞，将细胞铺于培养板中的盖玻片上，进行细胞计数，调整细胞密度为（2.5～3.0)x10⁶个／ml，在37℃条件下静置培养。培养2～4天后改用含5～10 umol/L胞嘧啶阿拉伯糖的培养液培养24小时，然后换成常规培养液。每隔2～3天换液1次。

【结果】

培养24小时后，大部分神经元已贴壁生长。神经元的胞体呈圆形或长杆状，核大而圆，核仁明显，可见有细小突起从胞体长出；培养3～5天后，细胞突起明显变长；培养10天后，细胞聚集成束，并开始退化。可用神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白和神经丝等免疫细胞化学方法鉴定神经元，培养的细胞中95％以上为神经元细胞。

【注意事项】

培养液中需加入高浓度的葡萄糖，以利于神经元的生长。如需维持较长时间神经元的培养，可将盖玻片放在单层神经胶质细胞支持物上进行培养。