甲状腺是人体内固有的内分泌腺之一，表面有结缔组织被膜。表面结缔组织深入到腺实质，将实质分为许多不明显的小叶，小叶内有很多甲状腺滤泡和滤泡旁细胞。甲状腺滤泡是甲状腺最基本的功能单位，人类甲状腺大约有300万个滤泡，滤泡是由单层排列的甲状腺滤泡上皮细胞构成，大小不等，呈圆形、椭圆形较多。只有甲状腺滤泡细胞才能产生机体不可缺少的甲状腺激素。甲状腺细胞体外分离培养为研究甲状腺的功能和临床甲状腺疾病提供了材料。由于甲状腺组织数量一般较少，给取材带来一定的困难。

【材料】

1．组织来源人孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织、功能亢进的甲状腺组织或甲状腺肿瘤组织均可作为研究的材料。

2．培养用试剂

(1) Hanks液：不含钙镁的CMF-Hanks液，加入100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素，pH 7.4。

(2)胰蛋白酶/EDTA液：0.05％胰蛋白酶和0.02% EDTA溶于不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中，pH 7.4。

（3）胶原酶Ⅳ。

3．培养基配方和制备DMEM添加15％～20％胎牛血清、0.6mmo1/L HEPES,12.5mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素，用5.6% NaHC0₃调至pH 7.0。

4．实验器材培养瓶、培养皿、100um不锈钢筛网、眼科镊、眼科剪和离心管等。

【方法】

1．取材取自外科结节性甲状腺肿手术患者，在结节0.5cm外剪下正常甲状腺组织1～3g，放入加有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的不含钙镁的Hanks的无菌容器中，立即送至培养室，时间不超过30分钟。若不能立即培养，可放在培养液中，4℃保存，但时间以不超过4小时为宜。在无菌条件下将组织移至平皿内，用眼科镊剥离去除被膜及结缔组织，并挤压出其中的血液成分。剪成lmm³左右的小块，用Hanks液漂洗2～3次，以看不到明显的红细胞为准。然后1000r/min离心5分钟，弃去上清液。

2．消化加入比细胞多5～10倍量的消化液（含0.25%胰酶和300U/ml胶原酶），在磁力搅拌器37℃水浴（200～300r/min )消化40～60分钟，肉眼观察无红色组织块或胶原上无红色黏附物为准。消化后加3～5 ml含10％血清的培养液终止消化。

3．分离细胞用100 um不锈钢筛网过滤，收集滤液于离心管中，1500r/min离心5分钟。吸去上清液，将细胞沉淀再用培养液洗涤2次，1000r/min离心5分钟后弃上清。收集未通过筛网的组织，加消化液继续消化，置磁力搅拌器37℃水浴15～30分钟，并过筛合并。在漂洗后的细胞沉淀中加入一定量的培养液，用吸管吹打数次，制成细胞悬液。吸取少量细胞悬液，加入锥虫蓝染液，在血细胞计数板上计数。用培养液稀释细胞至浓度为1x10⁶/ml。

4．接种与培养接种细胞悬液到培养瓶或培养皿中。轻轻振摇后放平，于37℃ ,5%C0₂细胞培养箱中静置培养。每2～3天换液一次，一般3～6天后细胞在培养瓶或皿中可长至80％～85%。待原代培养的甲状腺细胞铺满瓶或皿底壁，吸出培养瓶或皿内原培养液，用37℃水浴预热的PBS洗涤2次。加0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液1 ml，轻轻倾斜培养瓶或培养皿使消化液浸润全部细胞，吸除0.8～0.9ml消化液，保留0.1～0. 2ml以免消化过程中细胞干涸。培养瓶或皿置于37℃恒温箱中静止消化2～3分钟。消化过程中在镜下监视细胞状态，一见细胞质回缩、胞体趋于变圆，加入含10％胎牛血清的培养液终止胰酶消化。用吸管轻缓吹打使细胞脱落，混匀成单细胞悬液。将细胞收集于15 ml离心试管中，1000r/min离心5～8分钟，弃上清液，再重复洗涤、离心1次。给细胞沉淀加入一定量的培养液，制成细胞悬液。按1:2比例接种新瓶，置37℃ ,5% C0₂细胞培养箱中培养。

【结果】

1．原代培养的次日，在普通光镜下观察可见细胞大部分已贴壁，细胞体积较小，细胞折光性好，为圆形，有的已铺展。一般10天左右即长成单层。人甲状腺原代细胞属上皮型贴壁细胞，细胞聚集紧密连接形成单层的上皮膜，部分区域细胞向上叠加生长，呈现“小岛”状，此时细胞呈扁平不规则多角形、短梭形，中央有一个或多个圆形核，细胞间边界清晰。当细胞伸展铺开后，外围细胞呈扁平不规则状，细胞边界不清，细胞生长数量多时，紧密连接，可见细胞边界，内部细胞尤其明显。传代培养时，一般在接种3～5天后细胞即可长成单层。

2．生长状况良好的细胞透明度大、轮廓不清，只有在相差显微镜下才能看清细胞的形态。细胞功能不良时细胞轮廓增强，胞质中出现空泡和其他颗粒物，细胞之间空隙加大，形态变化不规则。

3．可通过测定培养液中甲状腺激素和甲状腺球蛋白含量和免疫荧光实验鉴定人甲状腺原代细胞。

【注意事项】

1．取材后宜尽快处理并进行原代培养，因为缺血时间短的组织细胞活性好，而对于原代细胞培养，接种细胞活性的好坏直接关系到培养的效果。

2．胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法。

3．消化时间应该依据具体情况而定，不宜每次实验都按照规定消化时间进行。对于仅为单纯孤立的甲状腺瘤而未合并甲状腺其他疾病的年轻术者的质地较软的组织，因组织较容易消化，消化时间可以适当缩短。

4．光镜下观察接种到培养瓶或培养皿中的原代培养细胞，如果大部分细胞为5～10个相连的细胞小团，就最容易生长；若大部分为单个细胞，则生长较差。但传代培养时，最关键的是要使细胞分散成单个细胞。若分散不好，细胞团块在接种到新的培养瓶后会造成细胞的早死。