（一）实验目的

1．掌握分光光度法测定水中挥发酚的原理和方法。

2．熟练掌握蒸馏、萃取预处理方法。

3．通过实验进一步掌握分光光度计的操作与测定原理。

（二）实验原理

萃取分光光度法原理：用蒸馏法使挥发性酚类化合物蒸馏出来，并与干扰物质和固定剂分离。由于酚类化合物的挥发速度是随馏出液体积而变化，因此，馏出液体积必须与试样体积相等。被蒸馏出的酚类化合物，于pH为10.0±0.2介质中，在铁氰化钾存在下，与4-氨基安替比林反应生成橙红色的安替比林染料，用三氯甲烷萃取后，在460nm波长下测定吸光度。适用于地表水、地下水和饮用水，检出限为0.0003mg/L，测定下限为0.00lmg/L，测定上限为0.04mg/L。

直接分光光度法原理：用蒸馏法使挥发性酚类化合物蒸馏出来，并与干扰物质和固定剂分离。由于酚类化合物的挥发速度是随馏出液体积而变化，因此，馏出液体积必须与试样体积相等。被蒸馏出的酚类化合物，于pH为10.0±0.2介质中，在铁氰化钾存在下，与4-氨基安替比林反应生成橙红色的安替比林染料。显色后，在30min内，于510nm波长测定吸光度。适用于工业废水和生活污水，检出限为0.0lmg/L,测定下限为0.04mg/L,测定上限为2.50mg/L;对于质量浓度高于标准测定上限的样品，可适当稀释后进行测定。

（三）仪器

1．分光光度计

萃取分光光度法；具460nm检测波长，并配有光程为30mm的比色皿。

直接分光光度法：具510nm检测波长，并配有光程为20mm的比色皿。

2．一般实验室常用仪器

【注】除非另有说明，分析时均使用符合国家A级标准的玻璃量器。

（四）试剂

①无酚水可按照以下两种方法制备。

a．于每升水中加入0.2g经200℃活化30min的活性炭粉末，充分振摇后，放置过夜，用双层中速滤纸过滤。

b．加氢氧化钠使水呈强碱性，并加入高锰酸钾至溶液呈紫红色，移入全玻璃蒸馏器中加热蒸馏，收集馏出液备用。

②硫酸亚铁（FeSO4·7H2O)。

③碘化钾（KI)。

④硫酸铜（CuSO4·5H2O)

⑤乙醚（C4H10O)。

⑥三氯甲烷（CHC13)。

⑦精制苯酚。取苯酚(C6HSOH）于具有空气冷凝管的蒸馏瓶中，加热蒸馏，收集182-184℃的馏出部分，馏分冷却后应为无色晶体，贮于棕色瓶中于冷暗处密闭保存。

⑧氨水ρ(NH3·H2O)=0.90g/mL。

⑨盐酸ρ(HCU=1.19g/mL。

⑩(1+9)磷酸溶液。

⑪(1十4)硫酸溶液。

⑫氢氧化钠溶液ρ(NaOH）=100g/L。称取氢氧化钠l0g溶于水，稀释至100mL。

⑬缓冲溶液pH=10.7。称取20g氯化铵(NH4C1）溶于100mL氨水中，密塞，置冰箱中保存。为避免氨的挥发引起pH值的改变，应注意在低温下保存，且取用后立即加塞盖严，并根据使用情况适量配制。

⑭4-氨基安替比林溶液称取2g4-氨基安替比林溶于水中，溶解后移入100mL容量瓶中，用水稀释至标线，必要时按以下方法进行提纯：将100mL配制好的4-氨基安替比林溶液置于干燥烧杯中，加入l0g硅镁型吸附剂（弗罗里硅土，60-100目，600℃烘制4h)，用玻璃棒充分搅拌，静置片刻，将溶液在中速定量滤纸上过滤，收集滤液，置于棕色试剂瓶内，于4℃下保存，可保存7d。

⑮铁氰化钾溶液ρ(K3[Fe(CN)6]）=80g/L。称取8g铁氰化钾溶于水，溶解后移入100ml,容量瓶中，用水稀释至标线。置冰箱内冷藏，可保存一周。

⑯溴酸钾一溴化钾溶液c(1/6KBrO3)=0.1mol/L。称取2.784g溴酸钾溶于水，加入l0g溴化钾，溶解后移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线。

⑰硫代硫酸钠溶液花(Na2S2O3)-0.0125mol/L。称取3.1g硫代硫酸钠，溶于煮沸放冷的水中，加入0.2g碳酸钠，溶解后移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线。临用前按照GB7489-87标定。

⑱淀粉溶液ρ=0.0lg/ml,。称取lg可溶性淀粉，用少量水调成糊状，加沸水至100mL，冷却后，移入试剂瓶中，置冰箱内冷藏保存。

⑲酚标准贮备液ρ(C6H5OH)≈1.00g/L。称取1.00g精制苯酚，溶解于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线。按以下方法进行标定。

吸取10.0mL酚贮备液于250mL碘量瓶中，加水稀释至100mL，加10.0mL0.lmol/L溴酸钾一溴化钾溶液，立即加入5mL浓盐酸，密塞，徐徐摇匀，于暗处放置15min，加入1g碘化钾，密塞，摇匀，放置暗处5min，用硫代硫酸钠溶液滴定至淡黄色，加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪去，记录用量。

同时以水代替酚贮备液做空白试验，记录硫代硫酸钠溶液用量。

酚贮备液质量浓度按下式计算：

ρ=（VI一V2)c×15.68/V

式中ρ——酚贮备液质量浓度，g/L;

V1——空白试验中硫代硫酸钠溶液的用量，mL;

V2——滴定酚贮备液时硫代硫酸钠溶液的用量，mL;

c——硫代硫酸钠溶液浓度，mol/L;

V——试样体积，mL;

15.68——苯酚(1/6C6H5OH）摩尔质量，g/mol。

置冰箱内冷藏，可稳定保存一个月。

⑳酚标准中间液ρ(C6H50H)=10.0mg/L。取适量酚标准贮备液用水稀释至100mL容量瓶中，使用时当天配制。

(21)酚标准使用液ρ(C6H5OH)=1.00mg/L。量取10.00mL酚标准中间液于100mL容量瓶中，用水稀释至标线，配制后2h内使用。

(22)甲基橙指示液可甲基橙）ρ=0.5g/L。称取0.1g甲基橙溶于水，溶解后移入200mL容量瓶中，用水稀释至标线。

(23)淀粉一碘化钾试纸称取1.5g可溶性淀粉，用少量水搅成糊状，加入200mL沸水，混匀，放冷，加0.5g碘化钾和0.5g碳酸钠，用水稀释至250mL,将滤纸条浸渍后，取出晾干，盛于棕色瓶中，密塞保存。

(24)乙酸铅试纸称取乙酸铅5g，溶于水中，并稀释至100mL。将滤纸条浸入上述溶液中，1h后取出晾干，盛于广口瓶中，密塞保存。

(25)pH试纸1-14。

（五）实验操作方法

1．样品采集与保存

在样品采集现场，用淀粉-碘化钾试纸检测样品中有无游离氯等氧化剂的存在。若试纸变蓝，应及时加入过量硫酸亚铁去除。样品采集量应大于500mL,贮于硬质玻璃瓶中。采集后的样品应及时加磷酸酸化至pH约4.0，并加适量硫酸铜，使样品中硫酸铜质量浓度约为lg/L，以抑制微生物对酚类的生物氧化作用。采集后的样品应在4℃下冷藏，24h内进行测定。

2．预处理

取250mL样品移入500mL全玻璃蒸馏器中，加25mL水，加数粒玻璃珠以防暴沸，再加数滴甲基橙指示液，若试样未显橙红色，则需继续补加磷酸溶液。连接冷凝器，加热蒸馏，收集馏出液250mL至容量瓶中。

蒸馏过程中，若发现甲基橙红色褪去，应在蒸馏结束后，放冷，再加1滴甲基橙指示液。若发现蒸馏后残液不呈酸性，则应重新取样，增加磷酸溶液加入量，进行蒸馏。

3．显色

萃取分光光度法：将馏出液250mL移入分液漏斗中，加2.0mL缓冲溶液，混匀，pH值为10.0±0.2，加1.5mL4-氨基安替比林溶液，混匀，再加1.5mL铁氰化钾溶液，充分混匀后，密塞，放置10min。

直接分光光度法：分取馏出液50mL加入50mL比色管中，加0.5mL缓冲溶液，混匀，此时pH值为10.0±0.2，加l.0mL4-氨基安替比林溶液，混匀，再加1.0mL铁氰化钾溶液，充分混匀后，密塞，放置10min。

4．萃取

萃取分光光度法：在上述显色分液漏斗中准确加入10.0mL三氯甲烷，密塞，剧烈振摇2min，倒置放气，静置分层。用干脱脂棉或滤纸拭干分液漏斗颈管内壁，于颈管内塞一小团干脱脂棉或滤纸，将三氯甲烷层通过千脱脂棉团或滤纸，弃去最初滤出的数滴萃取液后，将余下三氯甲烷直接放入光程为30mm的比色皿中。

直接分光光度法不进行萃取。

5．测定

萃取分光光度法：于460nm波长，以三氯甲烷为参比，测定三氯甲烷层的吸光度值。

直接分光光度法：于510nm波长，用光程为20mm的比色皿，以水为参比，于30min内测定溶液的吸光度值。

6．空白试验

萃取分光光度法：用水代替试样，按照步骤1-4测定其吸光度值。空白应与试样同时测定。

直接分光光度法：用水代替试样，按照步骤1-3测定其吸光度值。空白应与试样同时测定。

7．校准

萃取分光光度法：于一组8个分液漏斗中，分别加入100mL水，依次加入0.00、0.25mL、0.50mL、1.00mL、300mL、5.00mL、7.00mL和10.00mL酚标准使用液，再分别加水至250mL。按照2-4步骤进行测定。

由校准系列测得的吸光度值减去零浓度管的吸光度值，绘制吸光度值对酚含量（P9）的曲线，校准曲线回归方程相关系数应达到0.999以上。

直接分光光度法：于一组8支50mL比色管中，分别加入0.00、0.50mL、1.00mL、3.00mL、5.00mL、7.00mL、10.00mL和12.50mL酚标准中间液，加水至标线。按照步骤2-3进行测定。

由校准系列测得的吸光度值减去零浓度管的吸光度值，绘制吸光度值对酚含量（mg）的曲线，校准曲线回归方程相关系数应达到0.999以上。

（六）结果计算与表达

萃取分光光度法：试样中挥发酚的质量浓度（以苯酚计），按下式计算：

ρ=(As一Ab一a)/bV

式中ρ——试样中挥发酚的质量浓度，mg/L;

AS——试样的吸光度值；

Ab——空白试验的吸光度值；

a——校准曲线的截距值；

b——校准曲线的斜率；

V——试样的体积，mL。

当计算结果小于0.lmg/L时，保留到小数点后四位；大于等于0.lmg/L时，保留三位有效数字。

直接分光光度法：试样中挥发酚的质量浓度（以苯酚计），按下式计算：

ρ=(As一Ab一a)/bV×1000

式中ρ——试样中挥发酚的质量浓度，mg/L;

As——试样的吸光度值；

Ab——空白试验的吸光度值；

a——校准曲线的截距值；

b——校准曲线的斜率；

V——试样的体积，mL。

当计算结果小于lmg/L时，保留到小数点后3位；大于等于lmg/L时，保留三位有效数字。

（七）干扰及消除

氧化剂、油类、硫化物、有机或无机还原性物质和苯胺类干扰酚的测定。

1．氧化剂（如游离氯）的消除

样品滴于淀粉一碘化钾试纸上出观蓝色，说明存在氧化剂，可加入过量的硫酸亚铁去除。

2．硫化物的消除

当样品中有黑色沉淀时，可取一滴样品放在乙酸铅试纸上，若试纸变黑色，说明有硫化物存在。此时样品继续加磷酸酸化，置通风橱内进行搅拌曝气、直至生成的硫化氢完全逸出。

3．甲醛、亚硫酸盐等有机或无机还原性物质的消除

可分取适量样品于分液漏斗中，加硫酸溶液使呈酸性，分次加入50mL、30mL、30mL乙醚以萃取酚，合并乙醚层于另一分液漏斗，分次加入4mL、3mL、3mL氢氧化钠溶液进行反萃取，使酚类转入氢氧化钠溶液中。合并碱萃取液，移入烧杯中，置水浴上加温，以除去残余乙醚，然后用水将碱萃取液稀释到原分取样品的体积。同时应以水做空白试验。

4．油类的消除

样品静置分离出浮油后，按照以上3操作步骤进行。

5．苯胺类的消除

苯胺类可与4-氨基安替比林发生显色反应而干扰酚的测定，一般在酸性(pH<0.5)条件下，可以通过预蒸馏分离。

（八）说明及注意事项

1．使用的蒸馏设备不宜与测定工业废水或生活污水的蒸馏设备混用。每次试验前后，应清洗整个蒸馏设备。

2．不得用橡胶塞、橡胶管连接蒸馏瓶及冷凝器，以防止对测定产生干扰。

3．两种方法每批样品均应带一个中间校核点，中间校核点测定值和校准曲线相应点浓度的相对误差不超过l0%。