微生物的生长、存活和死亡是微生物学工作者每天都要面对和思考的主题之一，一个灭菌工艺的灭菌效果也是以微生物的死亡数量来评价的。通过了解细菌的生长、存活和死亡相关的因素，详细探讨微生物死亡的规律，可以为理解和评价灭菌工艺效果提供理论基础。

（一）影响细菌生长的因素

尽管在微生物控制和要求方面，食品、药品和化妆品均有所不同，但控制的原理大同小异，因为微生物的生长、存活和死亡遵循一定的规律性。单细胞细菌以无性二分裂（binaryfission）的方式生长。在适宜的条件下，特定细菌细胞的分裂生长速率是恒定的，以几何级数增长。微生物学实验表明，细菌的生长速度可用下式表示。

Nt=N0×2n

式中，Nt表示在t时间的细胞数量；N0表示起始细胞数量；n表示细胞分裂的代数。

细胞结构简单，细菌细胞的分裂和扩增速度非常快，如大肠埃希菌在适宜的生长条件下，大约20min其细胞数量就能增加一倍。

事实上，细菌细胞的分裂和生长会受到诸多条件的制约和影响。

1．物理条件

(1)温度每种细菌只能在一定的温度范围内生长，因此有最低、最高和最适生长温度条件。根据最佳生长温度条件，细菌可被分为嗜冷菌（psychrophile，最适生长温度为-5℃-15℃)，中温性细菌（mesophiles，最适生长温度为25℃-45℃)，高温性细菌（hyperthermophiles，最适生长温度为70℃-110℃）。

(2)氧气不同细菌生长时对氧气的需求各有不同，大致可分为以下五种。需氧型(obligateaerobes)，只有在氧气下才能生长，通过有氧呼吸产生能量；微需氧型(microaerophiles)，在低浓度氧气（2％-10%）下呈现最佳生长，通过有氧呼吸获取能量；厌氧型(obligateanaerobes)，只有在无氧条件下才能生长，通过厌氧呼吸或发酵获取能量；厌氧耐氧型(aerotolerantanaerobes)，如同厌氧菌不以氧气为最终电子受体，但可以在有氧条件下生长，只通过发酵获取能量；兼性厌氧型(facultativeanaer-obes)，在有氧或无氧条件下均能生长，但通常在有氧条件下生长更佳，在有氧条件下进行有氧呼吸，在无氧条件下通过无氧呼吸获取能量。自然界中绝大多数细菌属于兼性厌氧型。

(3)pH与酸碱度根据细菌在最佳生长状态下pH要求，可将细菌分为以下三类。中性细菌（neutrophiles)，在pH为5-8范围内生长最佳；嗜酸性细菌（acidopiles),pH小于5.5环境中生长最佳；而嗜碱性细菌（allaliphiles）则在pH大于8.5环境中生长最佳。无论在酸性或碱性环境中，细菌细胞内的pH总是稳定在中性。

(4）水活度（aw）水活度是用来表示某特定环境中可被微生物吸取并利用的水的含量。水活度是以在特定温度下某被测定物中水的蒸发气压的比值来表示，其数值范围为0-1.0。一般来说，绝大多数细菌要在水活度为0.95以上的环境中才能生长；少数革兰阳性细菌所需水活度可降到0.9。霉菌和酵母菌可在水活度为0.8以上的环境中生长。多数嗜盐菌和耐旱型霉菌可在水活度为0.61-0.8的环境中生长。目前，尚未发现有微生物可在水活度为0.6以下的环境中生长。在水性溶液中，水活度与渗透压相互关联。在渗透压高的溶液中水活度相对较低。如0.9％生理盐水的水活度为0.995;而7％氧化钠溶液的水活度为0.96（约与40％蔗糖溶液的水活度相当）。对口服类制剂如片剂、胶囊、油性和糖浆类药物，水活度是控制和评价微生物生长的有效手段。将不同因子综合利用，能有效控制微生物的分裂和生长。

2．营养要求

除了要具备适当的物理环境条件，微生物的生长还要依赖于化学营养物质。按能量的来源途径，细菌可分为光合营养菌（利用光作为主要能量来源）和化能营养菌（通过化合物的氧化和还原反应作为主要能量来源）。按碳的来源，细菌可分为自养菌（只需要二氧化碳）和异养菌（以有机碳化合物作为碳源）。因此，可将所有细菌按其不同的营养方式分为以下四类：光合自养菌、光合异养菌、化能自养菌和化能异养菌。

光合自养菌（photoautotrophs)，主要是指光合细菌，如绿硫菌、紫硫菌和蓝细菌。此类细菌利用光能通过光合作用将二氧化碳和水转化成碳水化合物和氧气。

光合异养菌(photoheterotrophs)，包括绿色非硫化细菌和紫色非硫化细菌。它们虽利用光能作为能量来源，但不能将二氧化碳转化为能量物质。此类细菌利用有机化合物作为碳源。

化能自养菌（chemolithoautotrophs)，利用无机化合物如氢、硫、氨、亚硝酸盐、氮气或铁作为能源，并且以二氧化碳作为它们的主要碳源。
化能异养菌（chemooganoheterotrophs)，利用有机化合物作为能量和碳源，腐生菌利用死的有机物为营养；而寄生菌从活的宿主体内获取营养。绝大多数细菌，所有的原生动物、真菌和动物都属于化能有机异养型生物。

除了能源和碳源外，细菌生长还需要氮源合成氨基酸、核酸和能量物质ATP，需要硫、磷、钠、钾、钙、铁等矿物质以及微量元素（锌、铜、锰、钼、硼等）。

（二）影响细菌存活的因素

影响细菌生长的因素也是决定细菌存活的因素，当每个因子的变化达到一定程度，细菌会处于非活跃状态（休眠）或死亡。但微生物在不同环境下的生理状态是复杂的，甚至有时难以界定其存活状态。

只有了解和掌握微生物的生长，存活条件，才能结合药品、食品或化妆品的特性对微生物进行有效而合理的控制。可根据产品的特性和对微生物的质量要求，制定多重措施控制微生物的生长和存活，利用多个不同胁迫条件的组合（如温度、防腐剂、水活度和pH等）协同性的抑制微生物生长。例如，绝大多数微生物在pH小于4.6的环境下不能生长；如果pH无法控制在4.6以下，可以考虑增加控制环境的水活度和（或）降低温度；或者通过增加防腐剂和冷藏或者辐射处理来控制微生物的生长。

（三）微生物的死亡

微生物的活性通常是以其是否能在培养基上分裂生长作为判断依据，但这样的判断有时也显得非常困难，因为所采用培养基及培养条件并不一定适合所有微生物细胞的分裂和生长。特别是当微生物细胞因受胁迫而受伤后，尽管没有死亡，但欲恢复其分裂和生长有相当的难度。因此，用培养生长法判断微生物是否死亡有其局限性。当然，现在也采用多种非培养方法来评判微生物的活性，这种方法多依赖于光电学、分子生物学、生物化学测定微生物细胞的某一生命体征是否正常作为判断依据。单个生命体征有时并不能反映出细胞的真实活性。因此，这些非培养方法的不足之处在于易产生假阳性结果。

研究发现，无论是通过物理还是化学方法杀灭某纯种单细胞，单位时间内死亡的微生物数量比例是相对稳定的。如果在某待灭菌样品内含有某特定纯种细菌的数量为N，在单位时间内灭菌后残存的活菌数的百分比是P，那么该样品经不同单位时间灭菌后残存的活菌数为：

由此可见，在特定的灭菌条件下，细菌数量是呈几何级数下降（死亡的细菌数相应地呈几何级数上升），且致死率可用常数k表示：

k＝(1/t)lg(起始微生物数量/残存微生物数量)

式中：t一细菌经受消毒或灭菌的时间。

为了更直观的发现微生物死亡的规律，可采用微生物死亡半对数方程来体现微生物死亡与时间之间的线性关系，即：

1gN＝一（U/Dr)＋1gN0

式中，N－经过时间t灭菌或消毒后的微生物数量。

N0一起始微生物数量。

U－将物理时间转换成在特定测试温度下的等效时间。

Dr－在温度T下，使微生物数量下降90％所需要的时间。

与高等生物或物理、化学不同，微生物数量往往比较庞大，因此分析微生物数据时，往往采用微生物数量的对数值更加方便。

通过微生物死亡规律的研究，有助于理解无菌保证标准与微生物存活率之间的关系，从而为灭菌工艺开发与设计提供理论基础。例如，对最终灭菌产品而言，一个可靠并经过验证的杀菌程序应确保灭菌后产品中污染品的概率不高于百万分之一，而百万分之一是一个概率，无法对其实际检验，只能通过发现微生物死亡规律加以推算而得出，从而避免因采用无菌检查法而产生的假阳性结果。