用MS鉴定蛋白质的多数方法中，经过1D或2D胶分离或不经分离直接鉴定，首先都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一种序列特异性的蛋白酶，只切割精氨酸或赖氨酸残基的C端。

1) 从胶上切下用于酶解的胶带，体积尽可能小，随后再将胶切成约lmm，的小块放于小离心管中。

2）用100mmol/L碳酸氢钱洗胶块5 min。

3）除去缓冲溶液，加50 μ1乙腈并使胶脱水10-15 min。如果胶块没有完全脱水就需要再换一次乙腈。

4）倾出乙睛，在Speed-Vac中完全干燥（在低温状态15min) ,用50μ1含有10mmol/L DTT的100mmol/L碳酸氢铰溶液（新鲜配置）再水化胶，在56℃下加热30min还原样品。

5）倾出DTT溶液，加乙腈于胶中15min后，在Speed-Vac中干燥（低温15 min )。

6) 加50 μl含有55mmol/L碘乙酰胺的100mmol/L碳酸氢铵溶液烷基化半胱氨酸残基，避光在室温下放置20min。

7）弃去上清液，用100mmol/L的碳酸氢钱缓冲液冲洗，然后换用新的碳酸氢铰缓冲液洗15 min，如果这一步还不能完全脱色，需用100mmol/L碳酸氢铵与等体积的乙睛混溶液在37℃振摇30min，重复此步骤直到完全脱色。

8) 倾出液体加入50 μ1的乙腈约15 min后，在Speed-ac中干燥，在50mmol/L包含测序级胰酶的碳酸氢氨溶液中再水化。酶的储存液是在25 μg的胰酶中加250μl的0.1％三氟乙酸。每份（15μl）储存在4℃。活性酶溶液的制备是每份15μl加100μl的50mmol/L碳酸氢铵溶液，终浓度是13 ng/μl。加入约20μl的胰酶溶液于胶块中（充分再水化后的胶块）并放置在4℃下再水化45-60min。

9) 移走过量的胰酶溶液，加入少量的50mmol/L的碳酸氢铵溶液(10-20μl）使胶块在酶解过程中保持浸润，在37℃孵育1h，然后在室温下过夜。

10）下一步样品处理是根据不同质谱鉴定方法来决定，主要有3种鉴定技术，按照被鉴定蛋白难易度而依次应用。

(1) MALDI-TOF MALDI-TOF是一种最有效的鉴定技术，它可通过肽指纹图谱(PMF）来鉴定蛋白质。用这种技术检测胰酶酶切后的肽质量数有很高的准确度，可与理论上预测的胰酶对蛋白酶切后所形成的一系列肤质量数比较（数据库查询）。由于大多数肽段只带一个电荷，在谱中以单峰的形式存在，因此MALDI-TOF MS数据很容易解释。对于基因组序列已完全确定了的生物体这种技术尤其有用，因为所有被胰酶酶切后生成的多肽质量数可以用一个封闭的数据包准确预测。与其他下面将讨论的技术不同，MALDI-TOF分析蛋白混合物和确定混合物中所有单个组分的能力较差。尽管如此，通过反复搜寻仍经常可从MALDI-TOF数据中鉴定出2-3个蛋白质。在该方法中，先将5％甲酸点到预先涂好基质的不锈钢靶上，然后将与甲酸等体积的酶解上清液直接加样于靶上，让靶自然干燥。用5％甲酸洗靶（1 ml/靶）。用高压气体吹干过量的洗液，最后将靶装入质谱仪进行测定。该方法用于微量多肽更为灵敏，但不适合源后裂解，因为靶的表面样品含量很快就会削减。

(2) ESI-MS/MS如得不到完整的序列信息，或当MALDI-TOF分析不能确定时，需要采用电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS )，来获得确定的序列信息以用于数据库的检索，或用于克隆实验。当应用MS/MS分析时，首先选择要测序的肤离子再由碰撞诱导解离（CID）得到其碎片离子，如果采用ESI-MS时，胰酶酶解的肽通常得到的是双电荷分子离子。纳升电喷雾（纳升流速的ESI）现在已经发展成为分析从1D和2D上分离得到的微量蛋白质的有利工具。蛋白质在胶上酶解后得到的酶切肽段样品1.0μl，经被拉伸成超微孔点的玻璃或石英针孔喷雾而出，一微升可以喷lh或更长的时间。这样，在温和能量碰撞下可重复进行许多次MS/MS实验。与快速数据库检索相联，可进行实时蛋白质鉴定。在同次喷雾中，还可进行进一步的确认实验，或对复杂混合物组分深入研究。另外，通常在三级四级杆质谱仪器中，这种方法可以通过母离子扫描来分析翻译后修饰如糖基化。最初磷酸肽和糖肽是基于从CID得到的特殊信号离子来鉴定的。所有的肤离子都有序地进入碰撞室，但是质谱所记录的是那些产生感兴趣的信号离子的母离子。纳米串联质谱相当灵敏并在鉴定生物学重要复合物时发挥着关键的作用。纳米喷雾接口可用在许多商业电喷雾质谱仪中。

(3) LC-MS/MS样品上样进行质谱分析的另一个方法是用在线LC-MS/MS，即在电喷雾接口前采用HPLC分离多肽。当多肽从色谱柱中流出时，质谱（Q-TOF, Micromass, Manchester, UK）自动选择母离子进行MS/MS分析。为了保证灵敏度，75到180μm大小的柱子采用低流速。这个系统比大孔径柱难于维护，但是一旦得到一个稳定的配置，他们将显示非常强大的功能。在线方法有几个优点，包括高灵敏度、在线脱盐和自动化等。当然每运行一次产生的几百个MS/MS图谱是相当大的文件，但是相应软件的出现使得预先不需对数据做任何说明就可以对完整的运行过程进行自动分析，而且数据库检索的速度已不成问题，能够在几分钟内就得出所有检索的结果。