检测酵母蛋白质半衰期通用的两种方法：脉冲示踪和启动子关闭。脉冲示踪通常用于检测外源蛋白或质粒组成型启动子所启动表达的蛋白质半衰期的检测。启动子关闭用于检测诱导启动子表达外源蛋白质的半衰期。

脉冲示踪

（1) 酵母培养准备

1) YPD过夜培养酵母，使之表达外源蛋白，或用缺失培养基过夜培养转入了选择性转化质粒的酵母，使之表达蛋白。

2）在30m1培养基中稀释过夜培养的酵母，使其OD600nm为0. 1。对数期OD600为0.4-0.6（见注解8)。

(2）脉冲示踪

1) 用台式离心机2000rpm、室温离心5 min，收集酵母细胞。彻底移弃上清。

2）用30m1 L-蛋氨酸缺失的培养基重悬细胞。转移到一个无菌培养瓶中，在回转式振荡仪上，30℃摇动lh。

3）将培养物转移到一个50ml Falcon离心管中。2000rpm离心、收集沉淀，用6m1 L-蛋氨酸缺失的培养基重悬沉淀。

4) 每毫升细胞物中，加入100-500μl标记表达35S-蛋白的Ci混合物，30℃摇l0min。见注解10在酵母细胞中检测温度敏感性蛋白质半衰期的有关事项。

5）离心收集细胞，并小心将放射性培养基移弃。

6）用6m1预热含有1 mg/ml L-蛋氨酸和1 mg/ml L-半胱氨酸的完全培养基重悬细胞（L-蛋氨酸和L-半胱氨酸要新鲜加入）。

7）立即将1. 4ml酵母培养物平均分配到2ml有螺旋帽的离心管中，作为“Time 0”组。离心14000r/min 15-20秒。移弃上清，并放在液氮保存，等待其他时间点样品的收集。

8）在预设的时间点平均分配1. 4m1酵母培养物，离心收集细胞沉淀，放液氮照步骤7操作。典型的时间点为：0, 10, 20, 40, 60和120分钟。但是时间的设定还应视具体情况而确定。

(3) 准备酵母提取物

1) 用30μl含有蛋白酶抑制剂的预冷RIPA缓冲液，重悬细胞沉淀。

2）每管中加入300μl acid-washed and ice-chilled玻璃珠（500μm)。

3) 在冰浴中剧烈振荡30秒。在冰上静置30秒。重复振荡和冰浴6次。

4) 4℃、14 000r/min离心l 0min。将上清移至新微量离心管中。再次离心10min。将上清移至另一新微量离心管中。

5）使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒或DC蛋白试剂盒检测蛋白浓度（Bio-Rad)。

6）将样品放在液氮中保存。

7) 免疫共沉淀、SDS - PAGE和放射自显影术，检测目的蛋白半衰期。