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植物细胞组织培养的研究可以追溯到1902年德国植物生理学家Haberlandt所进行的杰出植物组织培养研究,至今已有100多年的历程,期间经历了许多里程碑式的研究,涌现出一批批杰出的研究者和科学家,根据其发展过程大致呵分为以下几个时期。
一、萌芽时期
在Sch1eiden和Schwann创立的细胞学说基础上,1902年德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断地被分割,直至单个细胞,也即任何高大的植物其实都是由单个细胞组成的,同时断言组成植物的细胞在合适的条件下具有发育成完整植株的潜力,这就提出了植物细胞全能性的理论。为了证实他的观点,他用植物的保卫细胞、叶肉细胞、髓细胞等进行了离体培养,但由于当时的认识水平和技术有限,他仅看到了细胞的生长、细胞壁的加厚,却未看到细胞的分裂。尽管如此,他提出的植物细胞全能性学说却引导着众多研究者不断探索,直至1958年Steward等终于将胡萝卜愈伤组织诱导出体细胞胚并长成完整小植株来,这时才可以说他的理论被后人的实验和丁作所完全证实。
1904年Hanning用无机盐和蔗糖溶液培养萝卜和辣根菜的幼胚,可以使其在离体条件下发育成熟。1908年Simon培育白杨嫩茎,观察到愈伤组织的发生和根、芽的形成。1909年,Kuster成功融合了植物原生质体。1922年,Robbins和Kotte成功培养了离体根尖。Laibach(1925,1929)把亚麻种间杂交形成的不能自然成活的幼胚在人工培养基上培养至成熟,为以后植物远缘杂交的胚拯救技术奠定了基础。1926年,Harlan进行了大麦幼胚的培养。在此时期,植物细胞组织培养进展很小,在胚培养和根培养方面进行了可贵的探索。
二、发展时期
1933年,李继桐进行银杏幼胚培养时,在培养基中添加根杏胚乳提取物,使幼胚能顺利发育成熟。1934年美国的white由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系,并反复转移到新鲜培养基中继代培养,使根的离体培养实验获得了真正的成功,并在以后28年间培养了1 600代。这之后,white又以小麦根尖为材料,研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响。并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基,其成分均为已知化合物,包括3种B族维生素,即吡哆醇、硫胺素和烟酸,该培养基后来被定名为white培养基。与此同时,Gautheret(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中,提出了B族维生索和生长素对组织培养的重要意义,并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年,white由烟草种间杂种的瘤组织,Nobecourt由胡萝卜根组织均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此,Gautheret、White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基,基本上都是由这3位科学家建立的。后来,white于1943年发表了《植物组织培养手册》专著,使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。
1941年,Overbeek在曼陀罗幼胚培养中开始首首次使用植物天然产物椰子汁作为培养添加物,使曼陀罗心形期胚培养获得成功,自此椰子汁被经常用于植物细胞组织培养中。1944年Skoog在烟草培养中发现生长素对根有促进作用并可抑制芽的发生。1946年,罗士韦培养菟丝子茎尖时观察到了花的形成,为利用植物细胞组织培养技术研究花的形成和发育开了先河。1948年,Skoog和崔徵在烟草髓部和茎段培养时,发现腺苷或腺嘌呤能解除IAA对芽的抑制作用,诱导形成丛生芽。1951年,Nitsch成功将花器各部分如果实、子房、未受精胚珠、花瓣等进行培养。1952年Steward用自己设计的细胞增殖器培养胡萝卜组织液体,发现了细胞增殖。同年Mo rel和Martin首次通过大丽花的茎尖分生组织培养获得了无毒苗。1953年,Muir率先把烟草和万寿菊的愈伤组织在液体培莽基上进行悬浮振荡培养,获得了由单细胞和细胞团组成的培养物并可继代繁殖;而且他还使用“看护培养”技术将冠瘿瘤组织分离培养获得单细胞,并建立了单细胞培养系。1955年De Ropp设计了“微室培养法”进行细胞培养。1956年Miller等发现了活性是腺嘌呤3万倍的激动素(kinetin)。1957年Skoog和Miller提出了植物细胞组织培养的激素调控模式是用激动素和生长素的比例控制芽和根的分化,比例高时生芽,比例低时生根。1958年,Steward等用胡萝卜根愈伤组织进行液体培养,再将含游离细胞的悬浮液继代培养,获得了胡萝卜体细胞胚并发育成完整植株,从而证实了植物细胞的全能性。1960年Bergmann设计了细胞琼脂平板培养技术。
在这一时期里,植物细胞组织培养的基本技术方法开始成熟,并建立了植物离体培养的技术体系;本时期植物细胞组织培养技术大多停留在实验研究阶段,生产应用尚少。
三、快速发展和应用时期
1960年开始,植物细胞组织培养进入了快速发展和应用时期,研究工作更为广泛和深入,研究技术不断完善,研究目标更为明确。
1960年,Cocking等用真菌纤维素酶分离番茄幼根原生质体获得成功,为今后原生质体培养和植物体细胞杂交研究奠定了基础。同年,Kanta成功开始了植物试管授精研究。Morel则利用兰花的茎尖培养获得了脱毒苗并快速繁殖兰花,这直接导致了随后的国际“兰化工业(orchid industry)”的兴起。1962年Murashinge和Skoog筛选出广泛使用的MS培养基。
1964年Guha和Maheshwari采用毛叶曼陀罗花药培养得到单倍体植株,随后Bourgin在1967年用烟草花药培养也获得了单倍体植株,从此开始了单倍体育种加速常规杂交育种的新途径。我国研究者在国际上率先完成了20多种植物的花粉培养,单倍体育种技术处于国际领先地位。
1970年Carlson在离体培养中筛选得到生化突变体;Power在同一年则成功进行了原生质体的融合。1971年,Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株,在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性,而且促进了体细胞杂交技术的发展,并为外源基因的导入提供了理想的受体材料,为基因工程奠定了良好基础。1972年Carlson利用原生质体融合得到了两个烟草品种的体细胞杂种。1974年Kao等发明了原生质体高钙、高pH PEG融合法。1975年Kao和Michayluk研发出原生质体培养专用的8P培养基,一直沿用至今。1978年Melchers等则首次获得了远缘杂交种——番茄与马铃薯的体细胞杂交种,为体细胞杂交技术展示了美好前景。同年,Murashige首提“人工种子”(artificial seed)研究,并为世界各国广为接受和推广。1981年,Larkin和Scoweroft提出体细胞无性系变异(somaclonal variation)的观点,为体细胞无性系的筛选和新的变异来源做了铺垫。
1982年Zimmermann发明了原生质体电融合法(electrofusion),大大加速了植物原生质体的研究,尤其是在作物的原生质体研究上,如水稻、大豆、小麦等均获得其原生质体植株的再生。
这一时期植物细胞组织培养技术获得了迅速发展,研究范围涵盖花药培养、花粉培养、原生质体培养和细胞融合等,并将此技术应用在果树、花卉、蔬菜、林木、中药材等的快速繁殖和脱毒苗生产,许多国家开始了产业化或工厂化的生产。同时也开始了大规模细胞培养生产植物次生代谢产物,工厂化生产植物天然产物已成现实。
更重要的是,从20世纪80年代初发现土壤农杆菌的植物遗传转化(genetic transformation)功能以来,全球迅速掀起了植物基因工程研究热潮。1983年Zambryski用根癌农杆菌转化获得了首例转基因植物。1985年Horsch设计了农杆菌介导的叶盘法(leaf discs),但都是转化双子叶植物;对单子叶植物的遗传转化则是于1987年由Sanford发明了基因枪法(partcle bombardment)后才解决的。但随后不久利用农杆菌转化单子叶植物也取得了突破,1991年Gould等用农杆茼转化玉米茎尖分生组织得到了转基因植株;1993年Chan等用农杆菌转化水稻未成熟胚获得成功,此后在小麦(cheng等,1997)、大麦(Tingay,1997)均获成功。至今为止,已有200多种植物获得转基因植株,大部分由农杆菌介导转化的。在世界主要生物技术发达国家,转基因作物如抗虫棉花、抗虫玉米、抗除草剂大豆等一大批转基因新品种已在生产上大面积种植。据估计目前全球转基因作物种植面积已接近2亿hm2。而且涉及重要粮食作物如水稻、小麦、大麦等的转基因研究也方兴末艾,许多转基因粮作品种正在评估和审定之中,相信不久的将来,主粮作物也会迎来转基因的春天。
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