黄酒是一种低酒精度的酿造酒，含有多种氨基酸及微量元素，被誉为“液体蛋糕”。黄酒以大米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成。著名的黄酒有无锡惠泉酒、绍兴加饭酒、丹阳封缸酒、福建龙岩沉缸酒和即墨老酒等。在黄酒生产过程中生产企业可以根据需要适量添加焦糖色素(通过普通法、氨法或亚硫酸铵法制得)，但禁止添加安赛蜜(乙酰磺胺酸钾)、苯甲酸、山梨酸、糖精钠，这4种食品添加剂分别有增加甜味及防腐作用。在江苏省质量技术监督局主导的黄酒产品质量监督抽查中，根据《黄酒产品质量监督抽查实施规范》要求必须检测这4个指标。目前，国内已有分别测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法，但没有出台同时测定这4种物质的国家标准。分开检测费时费力，不但不能提高仪器使用效率，还影响整个监督抽查工作的进度。笔者研究了同时检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法，旨在为大批量的黄酒样品的快速、准确检测与便捷数据处理提供参考依据。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1200LC型，带G1315D型二极管阵列检测器和LC3D系统化学工作站，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：BSA2202S型，德国赛多利斯科学仪器有限公司；

超声波清洗器：AS20500A型，天津奥赛恩斯仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH–6型，常州国华电器有限公司；

超纯水机：Direct-Q3型，法国Millipore公司；

黄酒样品：生产企业成品库随机抽取；

亚铁氰化钾溶液：106g／L；

乙酸锌溶液：220g／L；

氨水溶液：0.1%；

乙酸铵溶液：0.02mol／L；

甲醇：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；

苯甲酸溶液[GBW(E)100006]、山梨酸溶液[GBW(E)100007]、糖精钠溶液[GBW(E)100008]：均为1mg／mL，中国计量科学研究院；

安赛蜜溶液（BW3510）：5，50，100，500，1000μg／mL，中国计量科学研究院；

标准工作溶液：量取适量标准溶液，用水稀释配制成所需浓度混合标准溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精钠为20，40，100，200μg／mL，安赛蜜为0.5，10，100，200μg／mL；

实验所用试剂除注明外均为分析纯；

实验用水：一级水。

1.2样品处理

称取5.00g试样于50mL比色管中，在水浴锅上去除酒精，用0.1%氨水调节pH至中性，分别加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL乙酸锌溶液(用于沉淀蛋白质)，定容至标线，混匀，放置2h，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，待上机分析。

1.3液相色谱条件

色谱柱：ZORBAXEclipseXDB–C18柱（250mm×4.6mm，5μm，美国安捷伦科技有限公司）；

流动相：甲醇–乙酸铵溶液(体积比为5∶95)，流量为0.7mL／min；柱温：30℃；检测波长：230nm；

进样体积：10μL。

1.4测定方法

按1.3测定标准工作溶液和样液，以待测物色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的标准工作溶液质量浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。同时记录待测物质的光谱图，并与标准品光谱图(见图1～图4)对照进行定性分析。

1.5色谱图

按1.3色谱条件进样分析，色谱图见图5。

2结果与分析

2.1色谱条件试验

2.1.1检测波长

在214，220，225，230nm处分别检测混合标准溶液，出峰顺序依次为安赛蜜(6.4min)、苯甲酸(7.9min)、山梨酸(11.0min)和糖精钠(13.2min)。

结果表明，安赛蜜、山梨酸在214nm处峰高最小，在225，230nm处峰高较大；苯甲酸峰高变化不大；糖精钠在230nm处峰高最小，在214nm处峰高最大。综合考虑检测的适用性和灵敏度，实验选择230nm为检测波长。

2.1.2流动相

固定检测波长，分别考察乙酸铵溶液(0.02mol／L)、甲醇–水、乙腈–水、甲醇–乙酸铵溶液等作为流动相对于待测物色谱峰的影响。

结果表明，采用乙酸铵溶液作为流动相时出峰时间较长；采用甲醇–水溶液、乙腈–水作为流动相时几乎不出峰，基线出现漂移；采用甲醇–0.02mol／L乙酸铵溶液(体积比为5∶95)作为流动相，能够很好地分离出4个峰，15min内就可以完成一次检测，为了尽量减少黄酒中夹杂物质(如糖分)对色谱柱的污染，实验设置检测时间为25min，以保证一定的时间冲洗色谱柱。

2.1.3色谱柱与柱温

实验选用安捷伦公司配备的ZORBAXEclipseXDB–C18柱进行检测，待测物质的峰形和保留时间都较好，故没有考虑其它型号的色谱柱。

在检测波长和流动相固定以后，对不同的柱温(25，30，35℃)进行考察。结果表明，柱温的改变，对待测物质的保留时间和灵敏度影响不大，但随着柱温降低柱压有所下降，实验选择柱温为30℃，既接近常温，又有较小的柱压，可以得到较为理想的色谱峰形和保留时间。

2.1.4流速的选择

固定检测波长、流动相、柱温、色谱柱，选择流速为0.7mL／min与1.0mL／min进行比较。结果表明，选用流速为1.0mL／min时，虽然出峰时间缩短，但4个峰紧密的排列在一起；选用流速为0.7mL／min时峰形分离效果较好，故选择流动相流速为0.7mL／min。

2.2工作曲线及检出限

根据所确定的实验条件，取系列浓度的混合标准溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，其中安赛蜜的浓度为0.5，10，100，200μg／mL，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的浓度为20，40，100，200μg／mL。在上述质量浓度范围内，质量浓度c与其对应的峰面积A呈良好线性关系(r＞0.9997)，线性方程与线性相关系数见表1。

按3倍信噪比除以线性方程的斜率计算检出限，本次检测的仪器噪音为0.0081，进样量10μL。则各待测物质检出限：安赛蜜为0.57μg／L；苯甲酸为0.53μg／L；山梨酸为0.29μg／L；糖精钠为0.74μg／L。

2.3精密度试验与加标回收试验

在1.3色谱条件下，以未检出本底的某黄酒样品做基质，在0.5，1.0，2.5，5.0，7.5mg添加水平时，每个添加水平重复6次测定，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

结果表明，安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的加标平均回收率在95.6%～104.0%范围内，测定结果的相对标准偏差在0.3%～1.5%范围内，回收率和精密度均满足实验要求。

3结语

建立了用高效液相色谱仪同时检测黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的方法。该方法简便、快速、结果稳定可靠，检出限、回收率和精密度均符合残留分析要求，适用于大批量的黄酒样品的快速准确检测与便捷数据分析。

作者：陈军

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