蛋白质的快速测定法有双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、水杨酸比色法、折光法、旋光法及近红外光谱法等。新一代微电脑的智能化分光光度计具有浓度直读功能及数据处理能力，能自动地将检测样品与标准进行比较，并直接给出样品的浓度。下面介绍双缩脲分光光度比色法。

1.原理

当脲被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲(也称双缩脲)，双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩豚反应。由于蛋白质分子中含有版键(—CO—NH—)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560mm。

2.试剂

(1)碱性硫酸铜溶液

①以甘油为稳定剂：将10mL 10mol/L KOH和3mL甘油加到937mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入50mL 40g/L硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)溶液。

②以酒石酸钾钠作稳定剂：将10mL 10mol/L KOH和20mL 250g/L酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入40mL 40g/L硫酸铜溶液。

配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。

(2)四氯化碳(CCl₄)。

3.仪器

(1)分光光度计。

(2)离心机(4000r/min)。

4.操作步骤

(1)标准曲线的绘制以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40，50，60，70，80，90，100，110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液(①或②)准确稀释50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min。取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

(2)样品的测定准确称取样品适量(使得蛋白质含量在40～110mg)于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质质量，进而由此求得蛋白质含量。

5.结果计算

式中X——蛋白质含量，mg/100g

m₁——由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg

m——样品质量，g

6.要点提示

(1)本法灵敏度较低，但比凯氏定氮法费用低、速度快，可在不到30min的时间内完成(凯氏定氮法至少需要2h才能完成)，是分析蛋白质最简单的方法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。

(2)蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。

(3)标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。

(4)含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。

(5)样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。

(6)当肽链中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。

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文章来源：《食品理化检测技术》

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