3.大肠菌群的测定(多管发酵法)

(1)应用范围。本法适用于饮用水、水源水，特别是混浊度含量高的水质中的大肠菌群的测定。水样中总大肠菌群的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。

(2)仪器。显微镜；革兰氏染色用有关器材；其他仪器同细菌总数。

(3)培养基。

1)乳糖蛋白胨培养液。

a.成分。

·蛋白胨，10g。

·牛肉膏，3g。

·乳糖，5g。

·氯化钠，5g。

·1.6%溴化钾乙醇溶液。

·蒸馏水，1000ml。

b.制法。将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调整pH值为7.2～7.4.再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中。以115℃灭菌20min，储存于暗处备用。

2)三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液。按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。

3)品红亚硫酸钠培养基(供多管发酵法用)。

a.成分。

·蛋白胨，10g。

·乳糖，10g。

·磷酸氢二钾，3.5g。

·琼脂，15～30g。

·蒸馏水，1000ml。

·无水亚硫酸钠，5g左右。

·5%碱性品红乙醇基的制备，20ml。

b.储备培养基的制备。先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH值为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装与烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。

c.平皿培养基的配制。将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此中培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。该种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周时间，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

4)伊红美蓝培养基。

a.成分。

·蛋白陈，10g。

·乳糖，10g。

·磷酸氢二钾，2g。

·琼脂，20～30g。

·蒸馏水，1000ml。

·2%伊红水溶液，20ml。

·0.5%美蓝水溶液，13ml。

b.储备培养基的制备。将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH值为7.2～7。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。

c.平皿培养基的配制。将上法制备的储备培养基加热融化。根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红溶液及一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱备用。

(4)检测步骤。

1)初发酵试验。在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中(内有倒管)内，以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养的试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37℃恒温内培养24h。

2)平板分离。经培养24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种与品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于37℃恒温内培养18～24h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。

品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落；伊红美蓝培养基上的菌落；深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。

3) 复发酵试验。上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中(内有倒管)；每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸气者(不论倒管内气体有多少皆按产酸产气论)，即证实有总大肠菌群存在。

4) 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管(瓶)数查表4.1.2，报告每升水样中的总大肠菌群。

表4.1.2 总大肠菌群数检数表

相关链接：水的微生物分析（二）

文章来源：《供水水质检测3》

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