叶酸的测定方法

                                                                   欧盟进口我国水产的检测要求

微生物法
1.原理
叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围
参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。
3.仪器与设备
（1） 恒温培养箱
（2） 离心机
（3） 高压消毒锅
（4） 震荡器
（5） 接种针和接种环
（6） 分光光度计
4.试剂
除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1） 菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）
（2） 磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。）
（3） 鸡胰酶溶液： 称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐）， 加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。临用前现配。
（4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。临用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。
（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7） 10mol/L NaOH。称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8） 叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。
（9） 叶酸标准中间液（200ng/ml）：准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。待标定。
标定：准确吸取1ml叶酸标准中间液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml。以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。

式中：
X1 -- 叶酸标准中间液浓度，ng/ml；
A -- 标准中间液平均紫外吸光度值；
E -- 摩尔消光系数24,500；
M -- 叶酸分子量441.42；
10-- 测定紫外吸光度值时的稀释倍数；
106 -- 由g/L换算成ng/ml的换算系数。
（10） 叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。
（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml。
（12） 酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma 公司），用10mol/L NaOH调节pH至 8.0（调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块）。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5ml甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h（此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）。将酪蛋白液从恒温箱中取出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液用水稀释至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的重量，蒸发皿内固体重量，如固体重量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量<40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。
（13） 黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10ml氨水，加热溶解，用水稀释至100ml。冰箱保存。
（14） 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶：分别称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml，加热溶解，用水稀释至100ml，室温贮存。
（15） 乙酸缓冲液（1.7mol/L,pH4.5）：38.65g无水乙酸钠，19.8ml冰乙酸，加水稀释至500ml。
（16） 维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3，20mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸吡多醇，4mg盐酸硫胺素，8mg泛酸钙，8mg尼克酸溶解于50ml水中。将上述两种溶液混合，加水至100ml。
（17） 吐温-80溶液：将2g吐温-80加入100ml 45℃水中，混匀。
（18） 还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100ml.
（19） 甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100ml，液面上加入少许甲苯保存。
（20） 乙盐溶液：称取2 g硫酸镁，0.5 g硫酸亚铁和0.5 g硫酸锰，加水至100 ml，液面上加少许甲苯保存。
（21） 基础培养基：按下表配制，最终定容至500ml。

加水至250 ml，搅拌，用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1，然后加入乙盐溶液2.5 ml，磷酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml。4℃冰箱内可保存一周 。
(甲、乙盐混合后易产生沉淀，所以配培养基时不可同时加入，加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基)
（22） 琼脂培养基：

加水至100 ml，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH 6.8±0.1。尽快倒入试管中，每管3～5 ml，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min,取出后直立试管，冷却至室温.于冰箱内保存。
5.菌种制备与保存
（1） 储备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养16～24 h。贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种。
（2） 种子培养液的制备：取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基，混匀，分装至4支5 ml离心管中，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min，实验时现制。
6.操作步骤
所有操作均需避光进行
6.1 样品制备
（1） 强化剂型样品：称取0.1～0.5 g样品（约含叶酸100～300 ng）于100 ml锥形瓶中，加入50 ml磷酸缓冲液，混匀。121℃高压水解15 min。定容至100ml，过滤。
（2） 果蔬类：称取样品0.2～2 g（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液经高压水解后过滤，残渣用同样缓冲液再次高压，过滤。合并两次滤液，定容至100ml。
（3） 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品：称取样品0.1-2 g（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液高压水解后， 冷却。加入1 ml鸡胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16～20h。酶解后定容至100ml过滤。另取一支试管，加入1 ml鸡胰酶，1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
（4） 口服液、饮料、果汁等样品：称取样品0.5～2 ml（约含叶酸100～300 ng），加磷酸缓冲液高压水解后， 冷却，加入1ml鸡胰酶，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16～20 h。酶解后定容至100ml，过滤。另取一支试管，加入1 ml鸡胰酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
6.2根据样品叶酸含量，将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数，使叶酸终浓度为0.1～0.4 ng/ml。
6.3样品管的制备：取4支试管，每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0 ml，补充水至体积为5.0 ml，加入5 ml基础培养基，混匀。同样制作酶空白管。
6.4 灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min。
6.5 标准系列管的制备：取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,相当于叶酸含量0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ng，加水补至体积为5.0 ml，再加5 ml基础培养基，混匀。如样品管一样进行灭菌。标准系列管进行平行测定。
6.6 接种
（1） 接种液的制备：接种前一天，用灭菌的接种针将菌种由储备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中，37℃±0.5℃恒温培养箱中培养16～24 h。混悬种子培养液，无菌操作下用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中，37 ℃±0.5 ℃再培养6h。震荡混匀，制成菌种混悬液。立即使用。（叶酸是L.C生长所必需的，但是如果培养基中叶酸含量过高，细菌可在体内贮存，使测定空白值，影响细菌生长曲线。将接种液转种再培养6h，有利于消耗细菌体内贮存的叶酸。）
（2） 接种：在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上述接种液（注意应直接滴在培养基内），混匀。留一支标准0管不接种，用于测定光密度时调零。
6.7 培养：置于37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养20～40 h。
6.8 测定：用分光光度计，在波长540 nm下，以未接种的标准0管调节零点，测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值。
7.计算
（1） 绘制标准曲线：以标准系列管中叶酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制叶酸标准曲线。
（2） 结果计算：根据样品管和酶空白管的光密度值，从标准曲线上查得相应的叶酸含量，按下式计算。

式中：
X--样品中叶酸含量，μg/100g；
c--从标准曲线上查得样品测定管中叶酸含量，ng；
P--从标准曲线上查得酶空白管中叶酸含量，ng；
V1--样品制备时定容体积，ml；
F--稀释倍数；
V2--制备样品测定管时加入的样品液体积，ml；
m--样品质量，g；
100/1000──样品含量由ng/g换算成μg/100g的系数。
8.注意事项
（1） 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值<10%。
（2） 微生物法的测定结果为总叶酸含量。
（3） 微生物法测定叶酸常用的菌种除L.C外还有粪链球菌（Streptococcus faecalis, S.F. ATCC 8043）。用L.C测定灵敏度高，用S.F.测定重现性好。本方法选用L.C，实验条件以适宜酪乳酸杆菌的生长条件而定。
（4） 常用的酪蛋白处理方法有酶水解法、酸水解法和碱水解法，由于叶酸在碱性条件下相对稳定，所以用碱处理酪蛋白不能完全破坏叶酸，使培养基中叶酸含量偏高，标准空白值高，线性差。酸水解法和酶水解法均可有效去除叶酸，降解蛋白，使细菌生长曲线在0～1ng范围内线性良好，其中实验证明酶水解法更好。
（5） 培养基的pH对细菌生长很重要，pH6.8～7.2，生长曲线最佳。PH过低或过高均不利于细菌生长。
（6） 本方法配制的培养基和Difico公司的叶酸培养基比较，标准曲线线性基本一致，对样品检测结果基本一致。
（7） 食物中叶酸多以多谷氨酸盐形式存在，而L.C只能利用叶酸单、双、三谷氨酸盐，所以对天然食品处理时先用轭合酶对叶酸进行降解。常用的轭合酶来源有血浆、鸡胰酶和猪肾酶。猪肾酶需从市售猪肾中提取，操作复杂，提取后对酶的坚定相对困难，且重复性差，酶的用量难于控制。鸡胰酶可从Difco公司购买，可直接使用，重复性好。鸡胰酶的用量与叶酸测定结果相关，以往报告中认为水解200ng叶酸需加入0.5～1mg鸡胰酶。也有人认为在pH7.0的环境下增加酶的用量可提高叶酸水解率。本实验室认为水解200 ng 叶酸，鸡胰酶用量宜控制在3～5mg左右，过高可降低水解效果。
（8） 轭合酶在应用中也有其局限性。天然食物中往往也含有轭合酶，在食物贮藏、运输过程中叶酸衍生物之间可发生相互转化，使外源性轭合酶作用下降；并且蔬菜水果存在一些酶的干扰物质也影响酶的活性，如柠檬酸、鞣酸等。所以测定中样品需注意保鲜，及时测定；样品处理方法也应视样品性质而定。
（9） 蛋白酶、淀粉酶的应用可将包裹于蛋白、淀粉之间或与蛋白结合的叶酸释放，有助于样品检测。蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶联合应用，水解效力大于3酶效力之和。