薄层色谱扫描法，亦称薄层光密度法，系用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，测定其对光的吸收强度或经激发后所产生的荧光强度，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定的方法。测定时可根据不同薄层色谱扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定。一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。

一、 薄层色谱扫描法的原理

(一) 薄层扫描方法

薄层色谱扫描法的测定方法可分为吸收测定法反射法测定与荧光测定法。根据对光吸收测定方式的不同，又可分为反射法以及透射法两种方式进行扫描。透射法大多用于凝胶色谱的扫描，非透明介质薄层板的扫描主要为反射式吸收法或荧光法扫描(图7-6)。

扫描方法可采用单波长扫描和双波长扫描。单波长薄层扫描适合于分离度好，背景干扰少的薄层。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱图中待测斑点的比移值(Rf值)、光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收和最小吸收应与对照标准溶液相透射法测定符，以保证测定结果的准确性。薄层色谱扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与标准物质同板点样、展开、扫描、测定和计算。

图7-6反射法及透射法薄层扫描路线示意图

根据扫描时光束的轨迹不同，薄层扫描又可分为线性扫描和锯齿扫描(图7-7)。线性扫描时一般采用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向做单向等速扫描，它适于形状较规则斑点的扫描。锯齿扫描使用的微小正方形光束在沿展开方向运动的同时，在垂直于展开方向也进行往复扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形，它对于形状不规则或浓度分布不均匀的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。

(二) 薄层扫描法定量测定的理论依据

在采用反射式吸收法测定时，入射光照射到薄层板上，一部分光透射过薄层板，一部分光发生反射，此外还有大量的散射光。因此，薄层扫描定量不遵从于Lambert-Beer定律，其样品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程：

(1-R)2/R=2.303εC/S..............(式7-1)

图7-7 线性扫描及锯齿扫描路线示意图

式中，R为反射光强，ε为样品吸收系数，C为样品浓度，S为薄层板散射系数。

反射式吸收法测定时，Kubelka-Munk方程是定量的依据，样品量与反射光强度不呈直线的线性关系。但是在一个较窄的范围内，曲线可近似为一条直线，从而采用外标一点法或两点法定量测定(图7-8)。如在测定范围内工作曲线直线回归线性关系较差，可根据不同仪器采用不同方法进行校正。

图7-8 薄层扫描线性工作曲线图
a和c之间为曲线，仪器的线性化器将其拟合为线性则可
采用两点法测定b的含量；a和a'之间距离较小，可视为
线性，在较小的范围内也可定量测定计算

在岛津CS系列薄层扫描仪上，有线性补偿器(Linarizer)，它可依据Kubelka-Munk方程用电路系统将曲线校正为直线后用于定量。CAMAG等薄层扫描仪则可使用二次方程曲线表达样品量与反射光强度之间的关系，进行定量测定。

相关链接：薄层色谱法及其在药品检验中的应用（三）

文章来源：《食品安全国家标准汇编食品添加剂(五)》

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