1 范围

本标准规定了体外哺乳类胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。

本标准适用于评价受试物的致突变作用。

2 术语和定义

2.1 TK基因

哺乳类动物的胸苷激酶基因。人类的TK基因定位于17号染色体长臂远端；小鼠的则定位于11号染色体。

2.2 突变频率

在某种细胞系中,某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的比例(单位通常为10^-6)。

3 试验目的和原理

TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。

TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需,原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMPO但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷，即trifluorothymidine,TFT),则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,进而掺入DNA,造成致死性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变,导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化,亦不能掺入DNA,故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数,可计算突变频率,从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同的集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起,而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变,或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

4 仪器和试剂

4.1 仪器

实验室常用设备、低温冰箱(-80℃)或液氮罐、生物安全柜、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机。

4.2 培养基

4.2.1 完全培养基

RPMl 1640培养液,加入10%马血清(培养瓶培养)或20%马血清(96孔板培养)及适量抗菌素(青霉素、链霉素的最终浓度分别为100 IU/mL及100ug/mL)。

4.2.2 THMG和THG选择培养基

THMG培养基：3ug/mL胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)+5ug/mL次黄嘌吟(hypoxanthine,H)÷0.1ug/mL氨甲喋吟(methotrexate,M)+7.5ug/mL甘氨酸(glycine,G)。

THG培养基：3ug/mL胸腺嘧啶核苷(T)+5ug/mL次黄嘌吟(H)+7.5ug/mL甘氨酸(G)。

以上浓度为各试剂在培养基中的终浓度。实际试验中，常按照表1的方法把THMG和THG配成100倍浓度：

表1 T、H、M、G试剂的配置

将4种试剂配制成上述1000倍浓度，再分别取此浓度的T、H、M、G溶液各5mL(共20mL)或T、H、G溶液各5mL(共15mL),均用双蒸水稀释至50mL,配成100倍的THMG或THG储备液。最后用滤膜过滤除菌,分装，-20℃下保存。应用时以1%的比例加入完全培养基。

4.2.3 CHAT和CHT选择培养基

CHAT培养基:1×10^-5 mol/L脱氧胞苷(CytOSinedeoxyriboside,C)+2×10^-4 mol/L次黄嘌吟(hypoxnathine,H)+1×10^-7 mol/L氨基喋吟(arninopterin,A)+1.75×10^-5 mol/L胸苷(thymidine,T)。

CHT培养基：1×10^-5 mol/L脱氧胞苷(C)+2×10^-4 mol/L次黄嘌吟(H)+1.75×10^-5 mol/L胸苷(T)。

以上浓度为各试剂在培养基中的终浓度。实际试验中，常按表2的方法把CHAT和CHT配成100倍浓度：

表2 C、H、A、T试剂的配置

将4种试剂配制成1000倍浓度,再分别取此浓度的C、H、A、T溶液各5mL(共20mL)或C、H、T溶液各5mL(共15mL),均用双蒸水稀释至50mL,配成100倍的CHAT或CHT储备液。最后用滤膜过滤除菌,分装，-20℃下保存。应用时以1%的比例加入完全培养基。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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