1 范围

本标准规定了蜂王浆和王浆冻干粉中链霉素和双氢链霉素残留量的酶联免疫测定方法。

本标准适用于蜂王浆和王浆冻干粉中链霉素和双氢链霉素残留总量的测定。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992, neq 3696:1987)

3 方法提要

本标准以酸性缓冲液来沉淀蜂王浆中蛋白质、提取残留的链霉素和双氢链霉素，然后以HLB柱净化。处理后样品中残留的链霉素和双氢链霉素与酶标记链霉素共同竞争结合链霉素抗体，同时链霉素抗体结合至包被有绵羊抗兔IgG的抗体的微孔板上，通过洗涤除去未结合的链霉素和双氢链霉素和酶标记链霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出蜂王浆中链霉素和双氢链霉素的含量。

4 试剂和材料

除去注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 链霉素检测试剂盒。

4.2 甲醇。

4.3 SDB缓冲溶液：称取1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，30g氯化钠，0.5 mL吐温-80，用水定容至1000 mL，用磷酸/氢氧化钠调节pH至7.5。

4.4 庚烷磺酸钠缓冲液：称取10.1g庚烷磺酸钠[CH₃(CH₂)₆SO₃Na],11.4g磷酸钠(Na₃PO₄·12H₂O)用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸调节pH至2.0。

4.5 10％甲醇：量取10 mL甲醇(4.2)用水定容至100 mL。

4.6 HLB小柱：oasis(或相当产品),3 mL(60 mg)。

4.7 链霉素和双氢链霉素标准品：纯度大于等于98％。

4.8 链霉素和双氢链霉素标准品溶液的配制：称取0.25 g链霉素或双氢链霉素，用甲醇定容至10 mL，配制成25mg/mL的储存液，于-20℃条件下保存。

5 仪器

5.1 酶标仪。

5.2 8道移液器：10 uL～100 uL。

5.3 单道移液器：10 uL～100uL,20uL～200uL,100uL～1000uL和2 mL～10mL。

5.4 混合振荡器。

5.5 高速低温离心机：6000r/min。

5.6 固相萃取装置。

5.7 氮吹仪。

5.8 具塞试管：50 mL。

5.9 电子天平：0.01g～100g。

5.10 酸度计。

6 试样的制备和保存

6.1 试样的制备

原始样品总量不得少于200 g，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻于粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样品装入洁净容器，加封并做标识。

6.2 试样的保存

试样放置-20℃～-18℃条件下保存。

7 分析步骤

7.1 提取

称取2.0g蜂王浆样品，置于50 mL具塞试管中，加入8 mL庚烷磺酸钠缓冲液(4.4)，充分混匀，15℃条件下6000r/min离心10 min直至清亮，取上层液备用。HLB小柱(4.6)，依次用1 mL 甲醇(4.2)和1 mL水活化，吸取1.5 mL样品提取液上柱，然后3 mL水洗，1 mL 10％甲醇(4.5)洗柱，去除残留的液体，氮气吹2 min干燥柱子。然后以2 mL甲醇(4.2)洗脱，将样品收集于干净塑料试管，氮气吹干。以3 mL SDB缓冲液(4.3)溶解吹干残留物，用于ELISA检测。最后样品稀释倍数为10。王浆冻干粉则用水以1：2比例稀释，充分浸泡(2 h以上)后，称取2.0g按照上述王浆前处理方法进行提取，最后以2 mL SDB缓冲液溶解吹干残留物，最后样品稀释倍数为20。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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