1 范围

本标准规定了蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的酶联免疫测定方法。

本标准适用于蜂王浆．及冻干粉中氯霉素残留量的测定。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)

3 方法提要

本标准以三氯乙酸来沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取残留的氯霉素，然后以HLB净化。微孔板中包被有绵羊抗兔IgG抗体，加入特异性抗体(兔抗氯霉素抗体)、酶标记氯霉素、氯霉素标准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔IgG抗体结合，同时游离氯霉素和酶标记氯霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的氯霉素和酶标记氯霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中氯霉素的含量。

4 试剂和材料

除注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 氯霉素检测试剂盒。

4.2 甲醇。

4.3 5％三氯乙酸：5.0g三氯乙酸以水溶解并定容至100 mL。

4.4 30％甲醇:30.0 mL甲醇(4.2)以水定容至100 mL。

4.5 异辛烷-三氯甲烷混合液：异辛烷、三氯甲烷以2:3(体积比)的比例混合。

4.6 HLB小柱：Oasis(或相当产品)，3 mL(60 mg)。

4.7 氯霉素标准品：纯度≥98％。

4.8 氯霉素标准品溶液的配制：称取0.01g氯霉素标准品，以甲醇定容至100 mL，配制100ug/mL的工作液，于4℃～8℃条件下保存。

4.9 空白样品：选用已确切知道不含有氯霉素的蜂王浆样品，作为空白样品。用于随样测试的加标监控实验。

5 仪器

5.1 酶标仪。

5.2 8道移液器：10 uL～100 uL。

5.3 单道移液器：10 uL～100 uL，20 uL～200uL，100uL～1000uL和2 mL～10 mL。

5.4 混合振荡器。

5.5 高速低温离心机：6 000 r/min。

5.6 固相萃取装置。

5.7 氮吹仪。

5.8 具塞试管：50 mL。

5.9 电子天平：0.01g～100g。

6 试样的制备和保存

6.1 试样的制备

原始样品总量不得少于200g，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻于粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样品装入洁净容器，加封并做标识。

6.2 试样的保存

试样放置-20℃～-18℃条件下保存。

7 分析步骤

7.1 提取

称取2.0g王浆样品，置于50 mL 具塞试管中，加入8mL 5％三氯乙酸(4.3)。充分混匀，6000r/min离心10 min，取上层液备用。HLB小柱(4.6)依次用1 mL甲醇(4.2)和1 mL水活化，取2.5 mL上层液上柱，依次以3 mL水，1mL 30％甲醇(4.4)洗柱，去除残留的液体，再用2 mL甲醇(4.2)洗脱，将洗脱液收集于一干净试管，氮气吹干，以0.5 mL样品稀释缓冲液(试剂盒提供)溶解残留物，最后加入0.5 mL异辛烷-三氯甲烷混合液(4.5)萃取，3000r/min离心10 min，取上层水相进行分析供ELISA检测用，最后稀释倍数为1。王浆冻干粉则用水以1:2比例稀释，充分浸泡(2 h以上)后，称取2.0g按照上述王浆前处理方法进行提取，最后稀释倍数为3。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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