1 范围

本标准规定了食品、化妆品和饲料中牛、羊(绵羊和山羊)、猪源性成分实时PCR检测方法。

本标准适用于食品、化妆品和饲料中牛、羊(绵羊和山羊)、猪源性成分的鉴别检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)

GB 19489实验室生物安全通用要求

3 术语和定义、缩略语

下列术语和定义、缩略语适用于本标准。

3.1 术语和定义

3.1.1

牛源性成分bovine-derived materials

牛种属特异性DNA片段。

3.1.2

羊源性成分ovine-derived materials

羊种属特异性DNA片段。

3.1.3

猪源性成分porcine-derived materials

猪种属特异性DNA片段。

3.1.4

实时荧光PCRreal-time fluorescent PCR

实时荧光聚合酶链式反应。

3.1.5

Ct值 Cycle threshold Ct

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.2 缩略语

3.2.1

DNA deoxyribonuleic acid

脱氧核糖核酸。

3.2.2

PCR polymerise chain reaction

聚合酶链式反应。

3.2.3

Taq Thermus aquaticu

水生栖热菌。

3.2.4

FAM 6-carboxyfluorescein

6-羧基荧光素。

3.2.5

ROX 5-carboxy-X-rhodamine

6-羧基-X-罗丹明。

3.2.6

HEX 5-hexachloro-fluorescein

6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素。

3.2.7

COX I Cytochrome C oxidase subunit I

细胞色素C氧化酶亚单位I。

4 原理

本标准采用TagMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA(COX I)基因上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法。牛、羊、猪源性成分单体系检测时，对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对牛或羊或猪的COX I基因及内参照反应同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质(FAM、HEX)的特异性探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测；牛羊源性成分混合体系检测时，对反应液中含有的三种不同荧光染料进行三通道同步检测，在同一反应管内分别对牛、羊特异的COX I基因及内参照(Internal Control)同时进行扩增，并通过标记三种不同荧光物质(FAM、HEX、ROX)的特异性探针进行特异性杂交，多色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。

5 材料与试剂

5.1设备和材料

5.1.1 实时荧光PCR检测系统。

5.1.2 高速台式冷冻离心机(最高转速12000r/min以上)。

5.1.3 台式离心机(最高转速2000 r/min)。

5.1.4 振荡器。

5.1.5 冰箱(2℃～8℃和-20℃或-80℃)。

5.1.6 微量可调移液器及配套吸头(10 uL、100 uL、1000uL)。

5.1.7 实时荧光PCR反应管。

5.1.8 离心管。

5.1.9 水浴槽。

5.1.10 加热器。

5.1.11 可移动紫外灯。

5.1.12 磁力架。

5.2 试剂

除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

5.2.1 基因组DNA提取试剂盒。

5.2.2 牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒。

5.2.3 羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒。

5.2.4 猪源性成分实时荧光PCR检测试剂盒。

5.2.5 牛羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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