(4)四环素类抗生素的检测

四环素类药物残留给动物及人类带来的危害不容忽视，其检测方法在世界范围内也备受关注。因此，精准分析检测兽药残留的组分对人类健康也有着重要的意义。四环素类抗生素残留检测的研究包括对样品的提取、净化以及对目标化合物进行分离检测两部分，其中，四环素类化合物的提取与净化是研究的重要环节，样品的提取、净化技术是否高效、快速的进行会影响样品分析方法的可靠性、准确性；而采用不同的检测技术对目标化合物进行分离检测是研究的关键。

①样品的提取与净化。由于测定的样品中成分复杂多样，在对四环素类抗生素残留量进行检测时干扰的物质较多，例如，样品中的高浓度的盐分以及存在的大分子蛋白质均会影响四环素类抗生素的色谱峰的峰形、保留时间、迁移时间等因素，因此，试样的提取和净化成为样品检测的重要环节，选择合适的方式进行提取和纯化显得尤为重要。

a．前处理。最大限度地达到以下两个要求：一方面，最大限度地提取目标化合物；另一方面，前处理过程还要最大限度地去除杂质，降低基质造成的干扰降低检测限等。目前，不同的四环素类抗生素的前处理方法有液-液萃取
(liquid-liquid extraction, LLE)、固相萃取(solid-phase extraction, SPE)、基质辅助固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion, MSPD)、分子印迹技术(molecular imprinting technique, MIT)、限进介质(restricted access materials,RAM)等。

b．液-液萃取。该提取方法的原理是在两种互不相容的有机溶剂中，分析物的溶剂间分配系数不同。该方法不需要特别严格的实验条件，对设备的要求不高，常用的有机溶剂有乙酸乙酯、三氯乙酸或者不同种有机溶剂间的混合物。但是，采用该方法进行操作时耗时长、选择性低、溶剂消耗量大、不符合现代仪器分析的总体发展趋势，并且当有样品发生乳化现象时会影响测定的结果，因此，该方法已经逐步被固相萃取所取代。但近几年，已有学者提出一种新型微萃取技术液液分散微萃取(dispersive liquid-liquid micro-extraction, DLLME)，该法操作简单、准确度高、对环境的污染小，短短几年取得了较大的研究进展。

c．固相萃取。该方法的原理是固体吸附剂能够将目标物吸附，从而达到目标物与干扰物质的分离和富集。其主要操作步骤有样品前处理、活化上样、洗脱剂洗脱及回收待测物等。与液-液萃取相比，固相萃取使用的样品体积及溶剂量会减少，另外对分析物的选择性性较高不会发生乳化现象，它还能与其他仪器联用实现自动化。近几年，在固相萃取的基础上，磁性固相萃取技术出现主要是在吸附剂上做了优化，采用磁性或者可被磁化的物质作为吸附剂，该方法的比表面积更大，消耗的溶剂较少，能够实现低浓度的微量萃取，同时还具有平衡时间短，萃取效率高等。

d．基质辅助固相分散萃取。该萃取技术的原理是将样品首先与填料混合研磨，使样品均匀混合在固定相颗粒表面，成为半固态后装人柱中，然后根据“相似相溶”原理选择合适的淋洗剂洗脱出各种待测物。该方法的优点是它将匀浆、提取和净化多个步骤融为一体，有效地减少了样品的损失，另外，该方法适用干农药兽药的多残留分析，特别适用于一个或者单个化合物的分离，该方法也常用于液体或者黏稠样品，对于含脂量大的原料也非常适用，目前提出已有20多年的历史。

e. 分子印迹技术。该方法的原理是将具有结构互补的功能化聚合物单体与模板分子目标化合物通过交联剂结合，然后用适宜溶剂将目标化合物洗脱出来，形成分子印记聚合物，该聚合物对口标化合物具有高特异性识别能力，能够高效识别目标化合物。但是，采用分子印迹技术时由于合成的分子印迹聚合物时需要大量的模板分子，给清除造成了一定的难度，所以会造成＜5％的模板分子残留。即使是1％的模板分子未被清除，这也将影响超微量成分的测定。

f.限进介质。该方法的原理是利用固定相表面疏水物质的排斥作用，限制基质复合物进入孔内，而小分子待测物则可以通过，这些小分子化合物则是通过疏水作用、离子作用、亲和作用下达到分离的目的。该方法具有净化样品完全、对目标分析物的选择性好等优点，可实现对复杂生物样品的分析。

②样品的检测方法。目前，复杂样品中四环素类抗生素的检测方法已经取得了很大进展，借助于灵敏度高的分析仪器，HPLC等大大拓宽了抗生素残留的分析范围，目前常用的抗生素残留分析方法有以下几种。

a．高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)。该检测方法分离效果好、灵敏度高，但是由于四环素类化合物易于与反向硅胶柱上残留的硅醇类化合物产生不可逆吸附，容易导致色谱峰出现峰形拖尾现象。因此，可以使用扫尾剂来改善峰形，常用的扫尾剂有草酸、磷酸、柠檬酸、甲酸以及磷酸氢二钠等。同时还可以结合各种类型的检测器使用，例如，荧光检测器灵敏度高、选择性强，适用于痕量物质的分析。另外还有化学发光检测器，高效液相色谱-单重四级杆质谱检测器等广泛用于四环素类抗生素的检测。

b．毛细管电泳法(capillary electrophoresis, CE)。该方法将传统的电泳技术与现代柱分离方法有效地结合起来，是一种很好的定量分析方法，在样品量很小的时候具有灵敏度高、分辨率好、分析速度快、环境友好、样品使用量少，能够实现多物质同时检测等优点。该方法的原理是将缓冲溶液装入毛细管柱中，当在毛细管柱的两端加上一定的电压时，带电荷的溶质便会朝着与电荷极性相反的电极方向移动。由于各组分的浓度不同，所以他们的迁移速度也不相同，所以经过一段时间后，各个组分就会按照速度或者浓度的大小进行排序，依次到达检测器被检出，最终将会得到按时间分布的电流谱图。

c.酶联免疫分析法(the enzyme-linked immunoassay, ELISA)。该方法是基于酶标记的免疫分析方法，避免了同位素标记的放射性污染和标记物衰变等缺点，操作相对简单方便，具有灵敏度高、特异性强、分析通量大、快速安全可靠等优点，在农兽药残留分析中得到了较快的发展。该方法通常是以半抗原形式与大分子量载体形成人工抗原，通过免疫动物产生对其具有特异性的免疫活性物质—抗体，从而与抗原发生体外结合反应，达到检测待测物的目的。

d．微生物学检测法。目前公认的测定抗生素类药物的经典方法，也是中国药典使用的方法。该方法成本低、操作简单、但是容易受到其他抗生素的干扰，并且检测灵敏度低。主要是根据对抗生素敏感的实验菌在适当的条件下产生抑菌圈的大小及药物的浓度成比例来评价的。四环素类药物的检测方法还有电化学分析法、化学发光分析法以及温室鳞片分析法等。

目前，国内外关于四环素类抗生素残留的样品处理技术和检测方法已有很多，随着对四环素类抗生素应用研究的不断深入，特别是四环素类抗生素在保鲜、防腐等方面的应用，对四环素类抗生素残留的分析也将不断深化。

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文章来源：《食品安全中的化学危害物》

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