6 试样制备与保存

6.1 试样的制备

从全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

6.2 试样的保存

将试样于-18℃保存。

7 测定步骤

7.1 试样溶液的提取

7.1.1 牛奶

称取5g试样(精确到0.01g)置于50 rnL离心管中，加入20 mL乙腈(4.3)，使用均质器(5.6)均质1 min，提取液使用高速冷冻离心机(5.7)在10℃10000r/min离心10 min，把上层提取液移至另一离心管中。用15 mL乙腈-水溶液(4.8)重复提取一次，合并两次的提取液，并加入10 mL乙腈饱和的正己烷(4.9)，振荡1 min，弃掉正己烷。把提取液移至100 mL鸡心瓶中，在40℃用旋转浓缩仪(5.9)旋转蒸发除去乙腈。

7.1.2 奶粉

称取0.5g试样(精确到0.01g)置于50 ml，离心管中，加入4.0mL水，使奶粉充分溶解，加入20 mL乙腈(4.3)，使用均质器(5.6)均质1 min，提取液使用高速冷冻离心机(5.7)在10℃ 10000r/min离心10 min，把上层提取液移至另一离心管中。用15 mL乙腈-水溶液(4.8)重复提取一次，合并两次的提取液，并加入10 mL乙腈饱和的正己烷(4.9)，振荡1 min，弃掉正己烷。把提取液移至100 mL鸡心瓶中，在40℃用旋转浓缩仪(5.9)旋转蒸发除去乙腈。

7.2 试样溶液的净化

向已除去乙腈的样品溶液中加入20 mL磷酸二氢钠缓冲溶液，然后用氢氧化钠溶液(4.10)调节至pH=8.5。把样品提取液移至下接Oasis HLB固相萃取柱(4.15)的贮液器中，以3 mL/min的流速通过固相萃取柱，先用5 mL磷酸二氢钠缓冲溶液洗涤鸡心瓶并过柱，再用2 mL水洗柱，弃去全部流出液。用2 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于刻度样品管(5.8)中，在40℃氮气浓缩仪(5.10)吹干，用2 mL水溶解残渣，摇匀后，过0.2 um滤膜(4.16)，供液相色谱-串联质谱仪测定。

7.3 空白样品添加标准混合工作溶液的制备

7.3.1 牛奶

分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液(4.14)，添加到5.0g样品中，按照7.1、7.2步骤操作，制得头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟浓度分别为4.0 ug/kg、8.0 ug/kg、16 ug/kg、40 ug/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。

7.3.2 奶粉

分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液(4.14)，添加到0.5g样品中，按照7.1、7.2步骤操作，制得头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟浓度分别为32ug/kg、64ug/kg、128ug/kg、320ug/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。

7.4 测定条件

7.4.1 液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a)色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈, 3.5 um,150 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b)流动相组成、流速及梯度程序见表1；

c)柱温：30℃；

d)进样量：20 uL。

表1 流动相梯度程序及流速

7.4.2 质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a)离子源：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测；

d)电喷雾电压：5500 V;

e)雾化气压力：0.055 MPa；

f)气帘气压力：0.079MPa;

g)辅助气流速：6L/min;

h)离子源温度：400℃；

i)定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)见表2。

表2 四种头孢菌素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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