根据检测目的和检测结果特异性水平不同，转基因食品的外源DNA检验方法可分为四类。

1.初筛试验(screening detection)直接检测大多数转基因生物中普遍存在的基因重组通用元件，包括35S启动子、胭脂碱合成酶终止子和抗性筛选基因NPT Ⅱ基因等。初筛试验仅能鉴别产品是否含有基因重组体，不能鉴定转基因产品的种类。由于自然界存在的花椰菜花叶病毒35S启动子可能会污染检测样品，所以需要通过进一步确认实验排除假阳性结果。

2．基因特异性试验(gene-specific detection)检测基因重组体中含有的外源性基因，特别是外源目的基因，从而提高检测结果的特异性。由于不同转基因品系所转入的目的基因不同，针对目的基因的检测可以大致区分转基因植物的品系差异。也可以针对标记基因或报告基因进行特异性检测。

3．组成结构特异性试验(construct-specific detection)鉴定和检测目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列。虽然不同的转基因植物品系可能采用了相同(或相似)的目的基因，但是由于和调控基因的连接方式和组成不同，所以对组成结构的检测可以区分植物不同的转基因株系，具有较高的特异性。

4．事件特异性试验(event-specific detection)检测插入的基因序列和植物基因组之间的连接区(cross-border)，鉴别同一插入序列在基因组中的重组状态差异。由于采用的基因重组体构成元件转化进入受体植物均为随机整合的非定向重组，所以转基因植物品系不同、同一转基因植物品系制备的时间不同、基因重组体插入受体植物基因的位置不同，使得插入序列与植物基因组之间的连接区具有特异性。因此，对连接区的检测可直接鉴定转基因植物的品系，其特异性最高。

食品中转基因成分的检测可根据检测目的不同，选择不同特异性水平的目标序列作为检测对象。如果是筛选目的，可选用通用元件，如35S、胭脂碱合成酶、NPT Ⅱ基因等；如果是鉴定目的，则选择特异性较强的组成结构特异性试验，对连接区域的序列进行检测。利用PCR技术可实现对上述目标序列的定性和定量检测。

(一)DNA提取及纯化

植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质中，细胞内各种DNA称为总DNA，其中95％以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细胞中还存在大量的多糖、蛋白质、脂肪、多酚类物质和RNA等成分。转基因成分检测时需要先提取总DNA，利用去污剂或有机溶剂破坏细胞膜，裂解细胞，使DNA与蛋白质分离并游离释放于提取液中，然后去除杂质成分。去除的杂质及采用的方法有：用相应的酶或溶剂去除果胶、纤维、半纤维、淀粉等多糖；用有机溶剂除去脂肪；用RNA酶或蛋白酶除去RNA或蛋白质；最后除去提取和纯化过程中所引入的各种溶剂和盐类物质等残留物。

DNA纯化的基本原理是根据乙醇或异丙醇竞争结合水分子能力远强于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或异丙醇，DNA因溶解度降低而沉淀析出。此外，根据DNA与树脂、吸附剂等有较高亲和力的特点，也可用阴离子交换树脂、二氧化硅等进行纯化。在提取和纯化过程中应注意保证DNA的纯度和一级结构完整性。

目前DNA提取方法主要有两类：一类是改进的传统方法，如苯酚一三氯甲烷法、溴化十六烷基三甲基胺(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)法、二氧化硅法等；第二类是试剂盒法。在传统方法中使用最多的是CTAB法，试剂盒法因操作简便等优点也有广泛应用。我国标准《转基因产品检测核酸提取纯化方法》(GB/T 19495.3)和《转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化》(NY/T 674)中规定了转基因产品核酸提取和纯化的方法。下面以CTAB法为例介绍DNA提取及纯化的主要步骤。

1．试样准备样品的制备方法视样品的状态和特性而定。固体试样宜研磨成大小在2mm以下的颗粒状，或用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA的提取要求；液态试样可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻干燥等方法得到干物质用于DNA提取。

2. CTAB法

(1)原理：CTAB能溶解细胞膜并能与DNA形成CTAB-DNA复合物。该复合物可溶于高盐溶液(NaCl)中，蛋白质、多糖等物质在此溶液中因溶解性降低生成沉淀，经离心后与复合物分离；然后将该复合物置于低盐溶液中，因其不溶性而沉淀析出，多糖、色素、多酚类物质溶于低盐溶液，经离心可进一步将复合物与其他杂质分离；最后将复合物沉淀溶解于高盐溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，离心后获得纯化的DNA。

(2)CTAB法主要试剂：该法的两个关键试剂是CTAB缓冲液和CTAB沉淀液。按表12-2配制试剂，调节pH至8，定容至200ml，高压灭菌。

表12-2 CTAB法核酸提取试剂(g)

(3)操作步骤：提取纯化DNA包括裂解、抽提、沉淀及洗涤等步骤组成。

1)称取一定量样品至离心管中，加入CTAB提取缓冲液和一定量RNase A酶，混匀后于65℃温育。所形成的CTAB-DNA复合物溶于提取缓冲液中，与蛋白质、多糖、多酚等物质分离。

2)高速离心，除去杂质沉淀。

3)上清液中加入三氯甲烷，混匀，高速离心，使上清液中残留的蛋白质、脂类、多糖、多酚类等杂质沉淀除去。

4)在上清液中加入CTAB沉淀液，混匀，静置后高速离心。沉淀剂使复合物发生沉淀，而残留杂质存在于上清液中，弃去上清液。在沉淀中加入氯化钠溶液使DNA溶解。

5)溶解液中加入三氯甲烷，高速离心弃去杂质沉淀。

6)上清液中加入预冷的异丙醇，混匀，静置后高速离心，该沉淀物即为纯化的DNA。

7)沉淀中加入70％预冷乙醇，洗涤纯化DNA。该操作重复两次。在室温或真空干燥系统中挥干溶剂，加去离子水或缓冲液溶解DNA保存备用。

3. DNA质量和纯度检测用琼脂糖凝胶电泳或核酸定量检测方法对所提取的DNA进行质量和含量的检测。

取一定量DNA在含溴化乙锭琼脂糖凝胶里进行电泳，紫外灯下观察DNA电泳条带，判断DNA的分子结构完整性、降解度及是否存在RNA污染。

取一定量DNA，用紫外分光光度计检测其260nm吸光度值，计算DNA含量。如果在260nm波长处检测溶液的吸光度值为1，则其中含有50ug/ml双链DNA，或38ug/ml单链DNA。根据A260/A280吸光度比值判断DNA溶液的纯度，一般比值在1.7～1.9的范围内纯度较高，适合于PCR检测；比值低于1.6，表明有蛋白质或有机溶剂污染；比值高于1.9，表明有RNA污染。纯度不符合要求的DNA提取液需要用酚/三氯甲烷进一步纯化。

4．方法说明

(1) CTAB法通过高盐和低盐的选择性沉淀能有效去除多糖类、多酚类和蛋白质等杂质，特别适合于多糖类、多酚类含量较高的植物样品处理。该法获得的DNA质量好、纯度高，但提取率较低。CTAB法结合活性炭、二氧化硅等改良方法可以提高DNA提取率。

(2) CTAB法一般需要约100mg样品提取DNA。对于深加工产品，因为DNA降解严重、含量较低，可适当增加取样量。

(3)如提取后立刻进行PCR检测，可用去离子水溶解DNA；如需较长时问后再检测，则用TE缓冲溶液溶解保存DNA。该缓冲液溶液能提供DNA稳定、适宜的pH; EDTA能抑制核酸酶活性，防止DNA降解。TE缓冲液组成为：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(hydroxymethyl aminomethane,Tris),1mmol/LNa2EDTA，调节pH至8。

(二)核酸PCR检测

PCR(聚合酶链式反应)由美国化学家K.B.Mullis等在1985年发明，他因此于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR法能在体外(试管内)扩增特定DNA序列，该法被发明后即应用于生命科学各个领域，是转基因生物检测使用最广泛的方法。

PCR反应体系由DNA模板、引物(根据模板序列设计的一定长度和顺序的寡核苷酸链)、四种脱氧核糖核酸(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP), DNA聚合酶(polymerase),镁离子和缓冲液等组成。模板DNA经高温变性成为两条单链，在适宜反应条件下两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的催化下以dNTP为底物，使退火引物延伸从而合成DNA，如此反复循环变性一退火(复性)一延伸三个基本反应步骤，使目的DNA片段呈几何倍数扩增。影响PCR反应的关键性因素是：DNA模板、引物、酶,dNTP和Mg²⁺，决定了是否能对目的DNA片段进行有效扩增，其中引物是最主要的因素，特异性引物的设计决定了对模板DNA某一目的片段进行扩增和扩增产物的特异性。引物多采用计算机软件根据引物设计原则，辅以人工分析设计而成。

我国标准《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》(GB/T 19495.4),《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》(SN/T 1202),《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》(GB/T 19495.5)等规定了转基因成分定性或定量PCR检测方法。

1．核酸PCR定性检测

(1)原理：定性PCR检测对象包括转基因食品的目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。根据转基因产品的特异性序列设计引物，对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依据扩增产物中是否存在预期特异性DNA片段，判断样品中是否含有转基因成分。

(2)分析步骤：在PCR反应管中依次加入提取纯化的DNA和反应试剂(引物、dNTPs混合液、氯化镁、PCR缓冲液、Taq酶等)，混匀，加入少量石蜡油后进行PCR扩增反应：反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸30秒；进行35次循环；72℃延伸7分钟。反应结束后取一定量PCR反应产物在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像观察并分析。

(3)方法说明：其体反应参数应根据检测对象和仪器进行适当调整。除了检测待测目标序列外，还需要检测内源参照基因。内源参照基因指在某种植物基因组中拷贝数恒定、不显示等位基因变化的基因。所选的内源参照基因应该是物种特异的、在种内普遍存在的。检测内源参照基因可以判定检测过程和结果的可靠性，避免出现假阴性结果。

为提高反应准确性，在试样PCR反应的同时，应设置阴性和阳性对照。在阳性对照PCR反应时，内源基因和待测样品的特异性序列均得到扩增，阴性对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。如果样品中内源基因和特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，则检测结果为阳性，试样中检测出转基因成分。

2．核酸PCR定量检测食品中转基因成分定量检测的方法主要包括半定量PCR法、实时定量PCR(real-time quantitative PCR)、竞争性定量PCR (double competitive PCR, DC-PCR)、数字PCR (digital PCR, D-PCR)等。实时定量PCR法是转基因产品定量检测最可靠的方法，根据检测原理的不同，又可以分为TagMan荧光探针法、SYBR荧光染料法、杂交探针法和分子信标法等。转基因食品检测最常用的是实时荧光定量PCR法。

实时荧光定量PCR是在普通PCR反应体系中，增加能与模板结合的两端有荧光基团标记的寡聚核苷酸探针。在PCR扩增时，两条引物分别与待扩增目的DNA片段的5'端和3'端互补结合；探针则与两条引物之间的目的DNA片段特异地互补结合。探针的一端标记报告(荧光)基团(reporter, R)，另一端标记淬灭基团(quencher, Q)。当探针完整的时候，由于探针的连接，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号。当探针被破坏时，发光基团与淬灭基团分离，利用检测器可检出发光基团发出的荧光。在PCR扩增过程中，利用Taq酶的5'→3'外切酶活性，接触到探针后逐渐将其切除，发光基团发出荧光信号。随着引物的延伸，每合成一条新链，释放出一个发光基团，故发光基团的荧光信号与PCR产物扩增完全同步，并随着PCR产物的积累而不断增加，因此，检测荧光信号的积累即可实时检测PCR的进程。扩增反应所经历的PCR循环数称为循环阈值Ct值。Ct是每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。Ct值与模板起始拷贝数的对数呈线性关系，在检测未知含量的样品时，以Ct值为纵坐标，以阳性标准物质(含量)或阳性标准分子(拷贝数)的对数为横坐标绘制成标准曲线，只要获得测试样品的Ct值，即可利用标准曲线计算出该样品中目标核酸的绝对含量。

下面以转基因大豆GTS-40-3-2为例介绍实时荧光定量PCR检测方法。

(1)原理：转基因大豆GTS-40-3-2具有抗草甘膦的特性，转入了CaMV35S启动子、Ctp4牵牛花叶绿体转移肽基因、Ctp4-Epsps 和Nos终止子外源基因。采用实时荧光PCR技术和标记荧光的探针，扩增测试样品DNA，并实时检测PCR产物。同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物(或阳性标准分子)，以获得稳定的标准曲线。根据内源基因和外源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)，并由绝对含量计算转基因大豆GTS-40-3-2在测试样品中的相对含量。

(2)分析步骤：设计转基因大豆GTS-40-3-2结构特异性基因及大豆内源Lectin基因所用引物序列和探针。在PCR反应管中依次加入提取纯化的DNA和反应试剂(引物、dNTPs混合液、PCR缓冲液、Taq酶、探针等)，混匀，加入少量石蜡油后进行PCR扩增反应。反应程序为：50℃延续120秒去污染；95℃活化DNA合成酶和预变性600秒；进行45次循环；95℃变性15秒；60℃延伸60秒。

(3)结果分析与计算：检测结果用统计分析软件进行分析和计算，获得待测样品外源基因和内源基因Ct值，根据外源DNA和内源参照基因的线性回归方程，计算获得待测样品外源DNA和内源参照基因的浓度或百分含量。

(4)方法说明：根据检测对象和仪器，适当调整PCR反应参数。实验中应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。

3. LAMP检测环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是由日本学者Notomi在2000年研发的一种采用恒温核酸扩增技术用于基因诊断的方法。LAMP技术特异性高，不需要热循环设备，具有操作简单、快速的优点。该方法在基层和现场检测方面将有广泛的应用前景。LAMP法先针对靶基因的几个区域设计数种特异引物，然后在链置换DNA聚合酶的作用下，于60～65 ℃恒温条件下进行核酸扩增。最后采用电泳、核酸染色、沉淀反应等方法检测核酸扩增产物是否有阳性扩增发生，据此判断样品中是否存在转基因成分。

文章来源：《食品理化检验》

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