(一)维生素A与维生素E同时测定

维生素A(vitamin A)是指具有视黄醇生物活性的一类化合物。食品中的维生素A包括β-胡萝卜素和视黄醇及其衍生物，植物性食品仅含有β-胡萝卜素和其他类胡萝卜素。维生素A是由β-紫罗酮环与不饱和一元醇组成的一类化合物及其衍生物的总称，包括维生素A1(视黄醇)和A2(3-脱氢视黄醇)及其各类异构体和衍生物，都具有维生素A的作用，总称为类视黄素。食品中的维生素A的总量用视黄醇当量(RE)来表示。维生素A的量可用国际单位(IU)表示，每一个国际单位等于0.3ug维生素A(醇), 0.344ug乙酸维生素A(酯)。

大多数天然维生素A类物质对氧和光线较为敏感，对酸不稳定，对碱较稳定，耐热性较好，且有其他抗氧化剂存在时可以经受煮沸。维生素A具有保持视觉正常、促进细胞生长与分化和维持上皮组织健康的生理功能。

维生素E(vitamin E)是具有生育酚活性的化合物的总称。食品中维生素E有a-生育酚、β-生育酚,γ-生育酚、δ-生育酚和相应的三烯生育酚等多种形式。由于不同形式的维生素E在体内利用率不同，其中a-生育酚活性最高。食品中的维生素E用a-生育酚当量(a-TE,mg)表示。维生素E为黄色油状液体，对碱和氧不稳定，对酸和热较为稳定，除油炸外一般烹调损失不大。维生素E具有抗氧化功能，与机体的生殖能力密切相关。

维生素A的测定方法有高效液相色谱法、三氯化锑分光光度法(GB/T 5009.82)、紫外分光光度法、荧光法等，其中三氯化锑分光光度法是通过维生素A与三氯化锑作用产生蓝色物质，通过测定吸光度值确定维生素A含量的方法。维生素E的测定方法有高效液相色谱法(GB/T 5009.82)、分光光度法、荧光分光光度法等。本节主要介绍高效液相色谱法，可同时测定维生素A和维生素E。

1．原理样品经皂化处理后，用有机溶剂提取其中的维生素A和维生素E，经C₁₈反相色谱柱分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，内标法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：称取一定量样品加入无水乙醇、抗氧化剂维生素C和内标物苯并[a]芘再加入氢氧化钾溶液(1+1)于沸水浴中回流皂化，冷却，皂化后的样品用乙醚提取，用水洗涤乙醚层，用pH试纸检验至水层不呈碱性，乙醚层经无水硫酸钠脱水，于55℃水浴中减压蒸馏浓缩，用氮气吹干后用乙醇定量，离心，上清液供色谱分析用。

(2)测定：色谱参考条件为C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm, 5um)；流动相：甲醇-水(98+2);紫外检测器波长：300nm；进样量：20ul；流速：1.70m1/min。

3．方法说明

(1)本方法最小检出限分别为维生素A 0.8ng、a-生育酚91.8ng、γ-生育酚36.6ng、δ-生育酚20.6ng。

(2)维生素A和维生素E的标准溶液临用时需用紫外分光光度法标定其浓度。实验操作应避光，采用棕色玻璃器皿，避免维生素的破坏。

(3)本法不能将β-生育酚和γ-生育酚分开，故γ-生育酚峰中含有β-生育酚峰。

(二)胡萝卜素测定

胡萝卜素(carotene)是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，包括a-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、玉米黄素，还包括叶黄素、番茄红素等，总称类胡萝卜素(carotenoids )。其中约1/10的类胡萝卜素可在小肠和肝细胞内转化为维生素A，称为维生素A原，最重要的一种就是β-胡萝卜素。就生理活性而言，6ug β-胡萝卜素相当于1 ug维生素A,β-胡萝卜素是维生素A的安全来源。

胡萝卜素溶于脂肪及大多数有机溶剂，对热、酸和碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜素作为一种色素，在450nm波长处有最大吸收。目前测定食物中胡萝卜素常用的方法有高效液相色谱法(GB/T5009.83)、纸层析法(GB/T 5009.83),薄层色谱法等，本节重点介绍高效液相色谱法和纸层析法。

1．高效液相色谱法

(1)原理：样品中的β-胡萝卜素用丙酮-石油醚(20+80)混合液提取，经三氧化二铝柱净化，采用C₁₈柱分离，紫外检测器检测，保留时间定性，峰高或峰面积标准曲线法定量。

(2)分析步骤

1)样品处理：取适量样品加入丙酮-石油醚(20+80)混合液反复提取直至提取液无色。合并提取液，在30～40℃水浴旋转蒸发至干残渣用石油醚溶解。先用丙酮-石油醚(5+95)冲洗氧化铝柱，上样，用同样的混合溶剂洗脱β-胡萝卜素，洗脱液定容后过0.45 um滤膜，备用。

2)测定：色谱参考条件为C₁₈柱(150mm×4.6mm, 5 um)；流动相：甲醇-乙腈(90+10);紫外检测器波长：448nm；流速：1.2ml/min。

(3)方法说明：①本方法最低检出限为5.0mg/kg (L)，线性范围为0～100mg/L。②层析柱中的三氧化二铝需预先于140℃活化2小时，取出放入干燥器中备用。③在采用丙酮-石油醚提取胡萝卜素时，若样品含水量较多，适当增加丙酮的比例，可提高提取效率。

2．纸色谱法

(1)原理：样品经皂化后，用石油醚提取胡萝卜素及其他色素，以石油醚为展开剂进行纸色谱，利用胡萝卜素极性与其他色素不同而分离，取含胡萝卜素的色谱带，用石油醚洗脱后于450nm波长下测定吸光度值。

(2)分析步骤

1)样品处理：取适量样品，加脱醛乙醇和氢氧化钾(1+1)熔液，皂化回流30分钟，用冰水冷却，再用石油醚提取至提取液无色。用水洗涤提取液至中性，无水硫酸钠脱水。提取液在60℃水浴中旋转蒸发浓缩，氮气吹干，石油醚定容，备用。

2)测定：在层析滤纸(18cm×30cm)底部上点2个条带，待纸上所点样液挥干后，置于石油醚饱和的层析缸中展开。待胡萝卜素与其他色素分开后，取出滤纸，自然挥干，剪下胡萝卜素色谱带，用石油醚溶解。于450nm波长下测定吸光度值，与标准系列比较定量。

(3)方法说明：①此方法最低检出限为0.11ug，线性范围1～20ug。该法不能区分a-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素，测定结果为总胡萝卜素；②为避免胡萝卜素的损失，操作需在避光条件下进行；③如果标准品不能完全溶解于有机溶剂中，必要时先将标准品皂化，再用有机溶剂提取，用水洗涤至中性后，浓缩，定容，再进行标定；④在皂化过程中加入脱醛处理的乙醇可以防止胡萝卜素的氧化。

(三)维生素D测定

维生素D (vitamin D)是具有胆钙化醇生物活性的一类化合物。有维生素D₂和维生素D₃两种主要形式，可由维生素D原(麦角固醇和7-脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。两者均为白色晶体，化学性质较为稳定，在中性和碱性溶液中耐热，不易被氧化，但在酸性条件下会逐渐分解，一般烹调加工维生素D不会损失。维生素D在人体内具有促进钙磷吸收，调节血钙等作用。

维生素D测定方法有高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法等。其中高效液相色谱法灵敏度高、分析速度快，是检测婴幼儿食品和乳品中维生素D的国家标准方法(GB 5413.9)。

1．原理样品皂化后，经石油醚提取，维生素D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，根据保留时间定性，标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：①皂化：含淀粉的样品先用a-淀粉酶60℃水解30分钟，不含淀粉的样品加水溶解。加入含维生素C的乙醇和氢氧化钾溶液，混匀，53℃水浴中皂化约45分钟，冷却至室温；②提取：在皂化液中加入石油醚提取两次，合并醚液，用水洗至近中性，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发至干，残渣用石油醚溶解并定容。取一定量上述溶液40℃氮气吹干，正己烷定容，离心待净化；③净化：将待净化液注入色谱仪中，经正相色谱柱分离，根据维生素D标准溶液保留时间收集样品馏分，于40℃氮气吹干，加入1.00m1甲醇溶解残渣，即为维生素D测定液。

净化色谱条件为：硅胶柱(150mm×4.6mm)，或具同等性能的色谱柱；流动相：环己烷-正己烷(1+1)，井按体积分数0.8％加入异丙醇；流速：1 ml/min；检测波长：264nm；柱温:(35±1)℃；进样体积：500ul。

(2)测定：将标准溶液和上述测定液注入液相色谱仪，根据峰高或峰面积标准曲线得出样液中维生素D₂(或D₃)的浓度。

参考色谱条件：C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm, 5um)，或具同等性能的色谱柱；流动相：甲醇；流速：1ml/min；检测波长：264nm；柱温:(35±1)℃。进样量：100ul。

3．方法说明

(1)本法适用于婴幼儿食品和乳品中维生素D的测定，也可不经过正相色谱净化同时测定维生素A和维生素E。方法检出限：维生素A为1ug/100g、维生素E为10.00ug/100g、维生素D为0.20ug/100g。

(2)测定维生素D的试样需要同时做加标回收率实验，用回收率对测定结果进行校正。

(四)维生素K测定

维生素K (vitamin K)又称凝血维生素，主要包括自然界中的叶绿醌类(维生素K₁)、甲基萘醌类(维生素K₂)和人工合成的维生素K₃。维生素K是黄色晶体，化学性质较为稳定，耐酸、耐热但易被碱和紫外线分解。维生素K，主要存在于天然绿色蔬菜和动物内脏中，是检测的主要目标。维生素K是肝中凝血酶原和其他凝血因子合成必不可少的物质。

维生素K的分析方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、气相色谱法等。其中高效液相色谱法(GB/T 5009.158)主要用于蔬菜中维生素K₁的测定；高效液相色谱法(GB 5413.10)适用于婴幼儿食品和乳品中维生素K₁测定，本节主要介绍前一种方法。

1．原理样品中维生素K₁用石油醚提取后，经氧化铝色谱柱净化，收集样液，浓缩，定容后经高效液相色谱分离，在248nm波长处用紫外检测器检测，标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：取适量样品用丙酮提取，提取液移至盛有硫酸钠溶液的分液漏斗中，残渣分别用丙酮和石油醚洗涤至无色，合并提取液和洗液，待静置分层后弃水相。再用硫酸钠溶液洗涤有机相至水相澄清，无水硫酸钠脱水，蒸发浓缩后氮气吹干，石油醚溶解。用经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱净化，收集石油醚样液，浓缩、氮气吹干，正己烷定容，离心备用。

(2)测定：参考色谱条件为预柱ODS (45mm×4.0mm，10um)，分析柱ODS(250mm×4.6mm,5um)；流动相：甲醇-正己烷(98+2);紫外检测波长：248nm；进样量：20ul；流速：1.5ml/min。

3．方法说明本方法适用于各类蔬菜、绿色植物及干制品中维生素K₁的测定，最低检出限为0.5ug，线性范围为1～100ug/ml。维生素K₁易在紫外光照射下分解，所有操作均需避光进行。

文章来源：《食品理化检验》

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