1 测量方法

依据中国药典微生物检定法的规定，效价定义如下：抗生素的抗菌效力通常用效价单位来表示，抗生素的效价单位均采用活性成分的质量1ug=1效价单位(u)的方法表示，效价测定是测量与标准品比较的相对效价(百分比)。

1.1实验条件

1.1.1仪器设备

(1)电子分析天平：

型号：Sartorius CP225D；最大量程：80g/220g；分度值：d=0.01mg/0.1mg, e=0.1mg/1mg。

(2)隔水式培养箱。

(3)抑菌圈测量仪：

型号：ZY300-IV；重复性相对标准差(RSD)的限界：≤1.0％；抑菌圈直径的测量允差：±0.5mm。

(4)移液管：5mL, A级。

(5)容量瓶：25mL、50mL、100mL、250mL，均为A级。

(6)双碟、毛细滴管、刻度吸管(均无须准确定量)。

(7)小不锈钢管。

1.1.2试剂与样品

(1)培养基：抗生素检定培养基工(pH7.9±0.1)，北京三药科技开发公司生产，批号：110505;

(2)试验菌：短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]菌液，(1→5)稀释后加人培养基(与培养基体积按0.3％比例)，冻干菌种由中检院出产；

(3)标准品：红霉素标准品(中检院出产，No. :130307-2007169938u/mg);

(4)样品：红霉素肠溶胶囊(深圳万和制药有限公司出产，批号:131101，规格：0.25g)；

(5)磷酸二氢钾、磷酸氢二钾：均为分析纯。

1.1.3实验环境

温度：25℃；相对湿度：50％

1.2测定方法与不确定度来源分析

1.2.1测定方法

操作流程如图1所示。

图1 操作流程图

按《中国药典》二部附录及《中国药品检验标准操作规范》抗生素微生物检定法“管碟法”的技术规定，测定步骤如下：

(1)试验准备

双碟(有盖子的培养皿称为“双碟”)、毛细滴管、刻度吸管、钢管的清洗及灭菌，容量瓶、移液管的清洗，培养基、缓冲液的准备，半无菌间的紫外消毒等。

(2)预试验

确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使预期的抑菌圈大小符合规定(高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18mm～22mm)。

(3)双碟的制备

每只双碟加底层培养基约20mL，平行制备10份(药典规定最终报告不少于4份)，待培养基凝固后，将双碟放入35℃～37℃培养箱中，待用。

(4)供试品、标准品溶液的制备

①供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，研细，精密称取供试品约0.4g(每粒胶囊内容物约0.4g，相当于红霉素0.25g，取第一个平行样的数据，W_T=0.4109g)，用乙醇25mL研磨分次转移置250mL容量瓶中(V_T=2S0mL)，加灭菌水至刻度，摇匀。分别精密量取5mL，置于50mL和100mL容量瓶中，分别加pH7.8磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀。再分别精密量取上述 50mL和100mL量瓶中的溶液5mL，置50mL和100mL量瓶中，分别加pH7. 8磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，即得高、低浓度(理论浓度)分别为10u/mL,5u/mL的供试品溶液。

②标准品溶液的制备：精密称取红霉素标准品约0.026g(Ws=0.02641g)，置于25mL容量瓶中(Vs=25mL)，用约3mL乙醇使之溶解，加灭菌水至刻度，摇匀，与供试品溶液制法相同，得到高、低浓度(理论浓度)分别为 10u/mL、5u/mL的标准品溶液。

注：制备供试品溶液和制备标准品溶液所用的5mL移液管、50mL和100mL容量瓶的容量和等级是相同的，并且体积在初始的计算公式(本案例未列出)中被约分了。此处认为它们的容量分散性也被抵消了。

(5)菌层培养基的制备

菌层培养基温度控制在50℃～60℃，根据预试验，加入0.3％的试验菌液，注意控制加入双碟菌层的速度和菌层的平整度。

(6)加小不锈钢管

(7)滴加供试品和标准品溶液至菌层培养基

按管碟法标准品、供试品溶液滴加顺序及高低剂量溶液的滴加顺序，控制加样操作，以保证滴加样品溶液的速度及量均匀一致。

(8)双碟的培养

将已滴加抗生素溶液的培养皿移置培养箱中，水平放置，37℃±1℃培养16h。

(9)抑菌圈的测量

使用抑菌圈测量仪，每组(一次测量)试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。

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文章来源：《食品药品检测测量不确定度评定实例》

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