12.6.7高效液相色谱法

高效液相色谱主要具有以下特点：

①高压。供液压力和进样压力都很高，一般是9.8～29.4MPa,甚至达到49 MPa以上。

②高速。载液在色谱柱内的流速很高，可达1～10 mL/min，甚至100 mL/min以上，分离速度快，一般可在1h内完成多组分的分离。

③高灵敏度。采用了基于光学原理的检测器，如紫外检测器灵敏度可达5～10 mg/L的数量级；荧光检测器的灵敏度可达10^-11g。高压液相色谱的灵敏度还表现在所需试样很少，微升数量级的样品足以进行全分析。

④高效。由于新型固定相的出现，具有高的分离效率和高的分辨本领，每米柱子柱效可达5000塔板以上，有时一根柱子可以分离100个以上组分。

⑤适用范围广。在室温条件下无法用气相色谱分离的高沸点或不能气化的物质，热不稳定或加热后容易裂解、变质的物质，生物活性物质或相对分子质量在400以下的有机物质，都可用高效液相色谱法进行分离分析。

12.6.7.1高效液相色谱法的类型

依据分离原理不同，高效液相色谱法可分为十余种，主要有液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法、体积排阻色谱法等。

(1)液-固吸附色-谱法

液-固吸附色谱法也称为液固色谱，使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上的分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。固定相是吸附剂，流动相是以非极性烃类为主的溶剂。分离过程是一个吸附一解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度为5～10um。适用于分离分子量为200～1000的组分，大多数用于非离子型化合物。液固吸附色谱传质快，装柱容易，重现性好，不足之处是试样容量小，需配置高灵敏度的检测器。该方法适用于分离极性不同的化合物、异构体以及进行族分离。不适用于含水化合物和离子化合物，离子型化合物易产生拖尾。

(2)液-液分配色谱法

根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。在液液色谱中，固定相是通过化学键合的方式固定在基质上。分离过程是一个分配平衡过程。不同组分的分配系数不同，是液液分配色谱中组分能被分离的根本原因。

液-液分配色谱法按固定相和流动相的相对极性，可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法。

①正相分配色谱法：采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正己烷、环己烷)，常加入异丙醇、乙醇、二氯甲烷等以调节组分的保留时间。一般用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)，极性小的组分先洗出，极性大的后流出。

②反相分配色谱法：通常用非极性固定相(如 C18、C81)。流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、四氢吠喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。通常适用分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先洗出，极性小的后流出。

(3)体积排阻色谱法

体积排阻色谱法也可称为凝胶过滤色谱。流动相是可以溶解样品的溶剂，固定相是有一定孔径的多孔性填料。小分子量的化合物一可以进入孔中，滞留时间长：大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。体积排阻色谱法广泛地应用于测定高聚物的分子量和分子量分布。该方法有保留时间短，易检测，普峰窄，可采用灵敏度较低的检测器、柱寿命长等优点。缺点是不能分辨分子大小相近的化合物。

(4)亲和色谱法

利用流动相中的生物大分子(氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷、酶等)和固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用能力的差别，对溶液中的溶质进行有选择地吸附从而达到分离的方法。当含有亲和物的试样流经固定相时，亲和物就与配基结合而与其他组分分离。待其他组分先流出色谱柱后，通过改变流动相的pH或组成，以降低亲和物与配基的结合力，将保留在柱上的大分子以纯品形式洗脱下来。

亲和色谱法是一种选择性过滤，具有纯化效率、高选择性强等特点，一步即可获得纯品，是分离和纯化生物大分子的重要手段之一。

12.6.7.2高效液相色谱的应用

高效液相色谱法更适合于热稳定性差、不易挥发的物质的分离和分析，应用更为广泛。目前已知的有机化合物中80％需用高效液相色谱进行分析。高效液相色谱法不仅可以分析组成简单的样品，还能对许多组成复杂、极性差异大的样品进行分析。

在生物化学和药学领域，HPLC应用极为广泛氨基酸及其衍生物、有机酸、甾体化合物、生物碱、抗生素、糖类、卟啉 、核酸及其降解产物、蛋白质、酶和多肽以及脂类等产物的分析。HPLC在生化医药方面引发了一场革命。如分子生物领域中对基因重整而得到的新基因的分离和纯化，单克隆抗体的纯化等方面；在将基因工程产品工业化生产时，使用HPLC能有效地将产品从发酵液中提取出来，得到纯度足够高且对人体无害的蛋白药物和疫苗产品。对于一般手段较难分离的异构体药物及亲脂性很强的药物，采用硅胶柱即可达到分离的目的。HPLC在对这类药物的质量控制．上，也具有重要意义。此外HPLC更是大幅缩短了样品的检测分析所需要的时间。

文章来源：《分析化学分析方法的原理及应用研究》

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