(一)实验原理

采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的阿维菌素类药物与酶标板上的偶联抗原竞争阿维菌素抗体，加入酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光值与阿维菌素类药物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出阿维菌素类药物残留含量。

(二)试剂和材料

1．阿维菌素类药物试剂盒

(1)96孔板(12条×8孔)包被有阿维菌素偶联抗原。

(2)阿维菌素标准溶液(至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白)。

(3)阿维菌素抗体溶液。

(4)过氧化物酶标记物。

(5)底物显色溶液A液过氧化尿素。

(6)底物显色溶液B液四甲基联苯胺。

(7)反应终止液1 mol/L硫酸。

(8)缓冲液(2倍浓缩液)。

(9)洗涤液(20倍浓缩液)。

2．乙腈、正己烷、无水硫酸钠(分析纯)。

3. 碱性氧化铝柱Sep-Pak Vac 12 cc (2g)。

4．水 GB/T 6682规定的一级水。

5．缓冲液工作液

用水将2倍的浓缩缓冲液按1:1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液＋1份水)，用于溶解干燥的残留物，缓冲液工作液在4℃可保存一个月。

6．洗涤液工作液

用水将20倍的浓缩洗涤液按1.19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃可保存一个月。

(三)仪器

1.酶标仪(配备450nm滤光片)。

2．超声波清洗器。

3．离心机。

4.氮气吹干仪。

5. 匀浆机。

6．振荡器。

7.涡旋式混合器。

8. 微量移液器(单道20、50、100 uL，多道50～300 uL可调)。

(四)试样制备与保存

取新鲜或解冻的动物组织，剪碎，10000r/min匀浆1 min。-20℃下保存。

(五)试样测定

1.甲提取

称取牛肉、牛肝试样(3.0±0.05)g于50mL聚苯乙烯离心管中，加9mL乙腈、3mL正己烷，置于振荡器上振荡10 min，加3g无水硫酸钠，再振荡10min, 3000r/min以上、15℃离心10min，去除上层正己烷，取下层4.0mL提取液备用。

称取3g无水硫酸钠平铺在碱性氧化铝柱Sep-PakVac上，加10mL乙腈洗柱，再加4.0 mL提取液，开始收集滤液，待提取液流干后，再加入4mL乙腈清洗柱子，合并洗液和滤液至10mL干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干。

取1.0mL缓冲液工作液溶解干燥的残留物，涡动1 min，超声10min,涡动1 min，取溶解后的样品液100uL，加入100 uL缓冲液工作液，充分混合，取20uL用于分析。

2. 测定

使用前将试剂盒在室温(19～25℃)下放置1～2h。

(1)将标准和试样(至少按双平行实验计算)所有数量的孔条插入微孔架，记录标准和试样的位置。

(2)加20 uL系列标准溶液或处理好的试样溶液到各自的微孔中。标准和试样至少做两个平行试验。

(3)加抗体工作液80uL到每一个微孔中，充分混合，于37℃恒温箱中孵育30min。

(4)倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250uL洗涤液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。

(5)加100uL过氧化物酶标记物，37℃恒温箱中孵育30min。

(6)倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250 uL洗涤液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。

(7)加50uL底物显色液A液和50uL底物显色液B液，混合并在37℃恒温箱避光显色15～30min。

(8)加50uL反应终止液，轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm处测量吸光度值。

(六)结果计算

用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式(5-5)：

式中Ar—相对吸光度值，％；

B—标准(试样)溶液的吸光度值；

B₀—空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。

将计算的相对吸光度值(％)对应阿维菌素(ug/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见式(5-6)：

式中X—试样中阿维菌素类的含量，ug/kg;

P—试样的相对吸光度值(％)对应的阿维菌素类含量，g/L ;

f—试样稀释倍数；

m—试样的取样量，g。

计算结果保留到小数点后两位。阳性结果应用确证法确证。

(七)交叉反应

阿维菌素：100%；埃普利诺菌素：130%；伊维菌素：33%；多拉菌素：5%；泰乐菌素：<0.1%；替米考星：<0.1%。

(八)精密度

本方法的批内变异系数＜30%，批间变异系数＜45％。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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