(四)ELISA的操作和注意事项

1．加样

在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交又污染。如此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型振荡器上振荡1min以保证混合。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

2．保温

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1～2h，产物的生成可达顶峰。保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴。

3．洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。现在多采用洗板机程序洗涤。

4．显色和比色

显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。

OPD底物显色一般在室温或37℃反应20～30min后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。TMB受光照的影响不大，经HRP作用后，约40min显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2h后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。

酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。普通的酶标仪A值在0.000～2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以“＊”或“over”或其他符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000～2.900，而其线性范围仅0.000～2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。也可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W₁)，第二次在不敏感波长(W₂)，两次测定间不移动ELISA板的位置。例如，OPD用492nm波长为W₁, 630nm波长为W₂，最终测得的A值为两者之差(w₁～W₂)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

5．结果判断

(1)定性测定定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“阳性”“阴性”表示。“阳性”表示该标本在该测定系统中有反应，“阴性”则为无反应。在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。

①间接法和夹心法：这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELISA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。

目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本(S)、阳性对照(P)和阴性对照(N)的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

a．阳性判定值：阳性判定值一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=(9±2)ng/mL。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NC_x)和阳性对照A值的平均数(PC_X)，两个平均数的差(PC_X-NC_X)必须大于一个特定的数值(例0.400)，试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NC_X，并≤1.5×NC_X，如其中之一超出此范围，则弃去，而另两个阴性对照重新计算 NC_X；如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：

阳性判定值＝NC_X+0.05       (5-1)

标本A值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生“试验无效”的后果。

b．标本/阴性对照比值：在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后，计算S/N值。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各白的S/N的阈值。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较低的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒，如N<0.05(或其他数值)，则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。

②竞争法：在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加人竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0～1.5之间，此时反应最为敏感。

竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。

a，阳性判定值法：与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为(125±100)u/mL。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值(NC_x)和阳性对照A值的平均数(PC_x)，两个平均数的差(NC_x-PC_x)必须大于一个特定的数值(例如0.300)，试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NC_x，并,1.5×NC_X，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NC_X；如有2个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：

阴性判定值=0.4×NC_x +0.6×PC_X        (5-2)

标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A值＞阳性判定值的反应为阴性。

b. 抑制率法：抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：

抑制率(％)＝(阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值          (5-3)

一般规定抑制率.50％为阳性，<50％为阴性。

(2)定量测定ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子质量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。测定小分子质量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同：ELISA测定的标准曲线中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

相关链接：酶联免疫吸附试验(ELISA)（二）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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