食品护色剂又称发色剂、呈色剂，是指能与肉及肉制品中呈色物质作用，使之在食品加工、储藏等过程中不致分解、破坏，呈现良好色泽的物质。在食品的加工过程中使用护色剂，能够较好的改善食品的感官性状及提高其商品性能。

护色剂一般泛指硝酸盐和亚硝酸盐类物质，它们本身并无着色能力，但当其应用于动物类食品后，腌制过程中其产生的一氧化氮能使肌红蛋白或血红蛋白形成亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白，从而使肉制品保持稳定的鲜红色。在国家食品安全标准GB 5009.33-2016中规定了三种测定食品中亚硝酸盐与硝酸盐的方法，分别为离子色谱法、分光光度法和紫外分光光度法。紫外分光光度法主要用于蔬菜、水果中硝酸盐的测定。

一、离子色谱法

(一)测定原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器或紫外检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。

(二)试剂和溶液

1．试剂

(1)乙酸(CH₃COOOH)，氢氧化钾(KOH)。

(2)乙酸溶液(3 %)量取乙酸3mL于100 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

(3)氢氧化钾溶液(1mol/L)称取6g氢氧化钾，加入新煮沸过的冷水溶解，并稀释至100mL，混匀。

(4)亚硝酸盐标准储备液(100mg/L，以NO₂^-计，下同)准确称取0.1500g于110～120℃于燥至恒重的亚硝酸钠标准品，用水溶解并转移至1000 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

(5)硝酸盐标准储备液(1000mg/L，以NO₃^-计，下同)准确称取1.3710g于110～120℃干燥至恒重的硝酸钠标准品，用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

(6)亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液准确移取亚硝酸根离子(NO₂^-)和硝酸根离子(NO₃^-)的标准储备液各1.0mL于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，此溶液每升含亚硝酸根离子1.0mg和硝酸根离子10.0mg。

(7)亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液，加水逐级稀释，制成系列混合标准使用液，亚硝酸根离子浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20mg/L；硝酸根离子浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg/L。

2．仪器和设备

(1)离子色谱仪配电导检测器及抑制器或紫外检测器，高容量阴离子交换柱，50 RL定量环。

(2)食物粉碎机。

(3)超声波清洗器。

(4)分析天平感量为0.1mg和1mg。

(5)离心机转速≥10000r/min，配50mL离心管。

(6)22um水性滤膜针头滤器。

(7)净化柱包括C₁₈柱、Ag柱和Na柱或等效柱。

(8)注射器1.0mL和2.5 mL

所有玻璃器皿使用前均需依次用2 mol/L氢氧化钾和水分别浸泡4h，然后用水冲洗3～5次，晾干备用。

(三)测定步骤

1．取样及预处理

(1)蔬菜、水果将新鲜蔬菜、水果试样用自来水洗净后，用水(GB/T 6682)冲洗，晾干后，取可食部位切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆，备用。如需加水应记录加水量。

(2)粮食及其他植物样品除去可见杂质后，取有代表性试样50～100g，粉碎后过0.30 mm孔筛，混匀备用。

(3)肉类、蛋、水产及其制品用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆，备用。

(4)乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪)将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

(5)发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。

(6)干酪取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

2．提取

(1)蔬菜、水果等植物性试样称取试样5g(精确至0.001g，可适当调整试样的取样量，以下相同)，置于150mL具塞锥形瓶中，加入80 mL水，1mL 1 mol/L氢氧化钾溶液，超声提取30min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15 min，上清液备用。

(2)肉类、蛋类、鱼类及其制品等称取试样匀浆5g(精确至0.001g)，置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，超声提取30min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，定量转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15 min，上清液备用。

(3)腌鱼类、腌肉类及其他腌制品称取试样匀浆2g(精确至0.001g)，置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，超声提取30min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，定量转移至l00mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15 min，上清液备用。

(4)乳称取试样10g(精确至0.01g)，置干100mL具塞锥形瓶中，加水80mL，摇匀，超声30min，加入3％乙酸溶液2mL，于4℃放置20min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，滤液备用。

(5)乳粉及干酪称取试样2.5g(精确至0.01g)，置于150mL具塞锥形瓶中，加水80mL，摇匀，超声30min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加入3％乙酸溶液2mL，加水稀释至刻度，混匀。于4℃放置20 min，取出放置至室温，溶液经滤纸过滤，滤液备用。

取上述备用溶液约15mL，通过0.22um水性滤膜针头滤器、C₁₈柱，弃去前面3mL(如果氯离子浓度大于10mg/L，则需要依次通过针头滤器、C₁₈柱、Ag柱和Na柱，弃去前面的7mL)，收集后面洗脱液待测。

固相萃取柱使用前需进行活化，C₁₈柱(1.0mL)、Ag柱(1.0mL)和Na柱(1.0mL)，其活化过程为：C₁₈柱(1.0mL)使用前依次用10mL甲醇、15mL水通过，静置活化30min。Ag柱(1.0mL)和Na柱(1.0mL)用10mL水通过，静置活化30min。

3．色谱参考条件

(1)色谱柱氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的二乙烯基苯-乙基苯乙烯共聚物基质，烷醇基季铵盐功能团的高容量阴离子交换柱，4mm×250mm(带保护柱4mm×50mm),或性能相当的离子色谱柱。

(2)淋洗液氢氧化钾溶液，浓度为6～70mmol/L，洗脱梯度为6mmol/L 30min，70mmo1/L 5min, 6mmol/L 5min，流速1.0mL/min。

若样品为粉状婴幼儿配方食品：氢氧化钾溶液，浓度为5～50mmol/L，洗脱梯度为5mmol/L 33min, 50mmol/L 5min，5mmol/L 5min，流速1.3mL/min。

(3)抑制器连续自动再生膜阴离子抑制器或等效抑制装置。

(4)检测器电导检测器，检测池温度为35℃；或紫外检测器，检测波长为226nm。

(5)进样体积50uL(可根据试样中被测离子含量进行调整)。

4．标准曲线制作

将标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰高(uS)或峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰高(uS)或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5. 试样溶液测定

将空白和试样溶液注入离子色谱仪中，得到空白和试样溶液的峰高(uS)或峰面积，根据标准曲线得到待测液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度。

(四)结果计算

式中X—试样中亚硝酸根离子或硝酸根离子的含量，mg/kg;

P—测定用试样溶液中的亚硝酸根离子或硝酸根离子浓度，mg/L;

P₀—试剂空白液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度，mg/L;

V—试样溶液体积，mL;

f—试样溶液稀释倍数；

1000—换算系数；

m—试样取样量，g。

试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐(按亚硝酸钠计)含量；试样中测得的硝酸根离子含量乘以换算系数1.37，即得硝酸盐(按硝酸钠计)含量。

结果保留2位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

此方法中亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.2mg/kg和0.4mg/kg。