(三)微生物(酶)毒性

直接测定法(Bitton et al. 1996)。测定的原理是利用一种能产生β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的大肠埃希菌(Escherichia coli)变种，所产生的阶半乳糖苷酶能与酶试剂-半乳糖毗喃苷酶氯酚红(CRPG; chlorophenol red-galactopyranosidase)形成红色，通过比色测定该酶的多少。若土壤有重金属毒性，该菌产生的酶就会减少，从而使颜色减轻。而且该菌对重金属毒性敏感，而对有机污染物不敏感。操作步骤如下：

1)样品测定称0.5～1.0 g土壤于透明而具密封盖的小瓶子中，加入0.9 mL 0.1 mol/L NaNO3和0.1 mL菌液(来自MetPLATETM test kit, Group 206 Technologies,Gainesville, FL,USA)，涡动振荡10s，在35℃恒温振荡下培养1h，再加入0.5 mL用0.15 mol/L磷酸缓冲液配制的125 mg/L的CRPG溶液，置于35℃恒温振荡下培养至形成明显的颜色，涡动振荡15s，过滤，在575 nm波长比色得到光密度，记为S。

2)有菌无土对照称好与样品1)一样多的土壤，但只是在全部培养反应形成颜色后加入，涡动振荡15s，等待2min，过滤，在575 nm波长比色得到光密度，记为Cs。

3)有土无菌对照与样品1)相同，但不加入菌液，而用0.1 mL 0.1 mol/L NaNO₃代替，记为SB。

4)无菌无土对照与有菌无土对照2)相同，但不加入菌液，而用0.1 mL 0.1 mol/L NaNO₃代替，记为CBS。

土壤重金属毒性用抑制率来表示，抑制率由下式计算得到：

抑制率＝[(C_s-CB_s)-(S-SB)]/(C_s-CB_s)            (12-12)

该法设多个对照，消除了土壤本身微生物的影响和土壤对颜色吸附等的干扰。

(四)动物毒性(鱼类毒性实验)

鱼类毒性实验是检测成分复杂的工业废水和废渣浸出液的综合毒性的有效方法。将本节水平振荡浸出方法得到的土壤浸出液做该检测，其结果也可作为判断土壤污染后毒性高低的参考。

(1)实验鱼的选择和驯养

实验用鱼以金鱼最适宜，必须是无病、健康的，其外观是行动活泼、体色发亮、鱼鳍完整舒展，逆水性和食欲均强，并无任何鱼病，鱼的大小和品种都可能对毒物敏感度不同，因此同一实验中要求选用同一批同属、同种和同龄的金鱼，体长(不包括尾部)约3 cm，最大鱼的体长不超过最小鱼体长的一倍半。新选来的鱼必须经过驯养，使它适应新的环境才能进行实验。一般是在与实验条件相似的生活条件下(水温、水质等)驯养一周或10天以上，实验前四天最好不发生死亡现象。正式实验的前一天应停止喂食。因为喂食会增加鱼的呼吸代谢和排泄物，影响实验液的毒性。

(2)实验准备

每种实验浓度为一组，每组至少10尾鱼。为便于观察，容器用玻璃缸，容积10 L(以10尾鱼计)左右，以保证每升水中的鱼重不超过2g。实验液中溶解氧对于温水鱼不小于4 mg/L，冷水鱼不小于5 mg/L。如试验液中含有大量耗氧物质时，为防止因缺氧引起死亡，应采用更换实验液、配置恒流装置等措施，但不宜采用人工曝气法。一般温度高毒性大，所以通常在鱼类生存适宜的温度条件下进行实验。冷水鱼适宜温度为12～18℃温水鱼适宜温度为20～28℃，同一实验中温度变化为±2℃。实验和驯养用水是未受污染的河水和湖水，pH对鱼类生存有影响，通常控制在6.7～8.5之间。如用自来水必须经过人工曝气或自然曝气三天以上，以赶走余氯和增加溶解氧，蒸馏水与实际差异太大，不宜做实验用水。

(3)实验步骤

1)预实验(探索性试验)为保证实验顺利进行，必须先进行探索性试验，以观察现象，确定实验的浓度范围。选用的浓度范围可大一些，每组鱼的尾数可少一些。观察24 h(或48 h)鱼类中毒的反应和死亡情况，找出不发生死亡、全部死亡和部分死亡的浓度。

2)实验浓度设计和毒性判定合理设计实验浓度，对实验的成功和精度有很大影响。通常选7个浓度(至少5个)，浓度问取等对数间距，例如：100、5.6、3.2、1.8、1.0(对数间距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(对数间距0.1)。浓度数值可用百分体积或mg/L表示。需要时也可用10的指数来乘或除，这些数值在对数纸上是等距离的。另设一对照组，如果对照组在实验期间鱼的死亡率超过10％，则整个实验结果不能采用。

实验开始的前8h应连续观察，随时记录。如正常，开始实验，进行24、48和96 h的观察记录。实验过程发现特异变化应随时记录，根据鱼的死亡情况、中毒症状判断土壤浸出液的毒性大小。如毒物的饱和浓度或所试土壤浸出液浓度在96 h内不引起实验鱼的死亡时，可以认为毒性不显著。

鱼类毒性实验的了TLm是反映毒物或工业废水(或土壤浸出液)对鱼类生存影响的重要指标。TLm值的计算要求必须有使实验鱼存活半数以上和半数以下的各浓度。在半对数纸上用直线内插法推导，方法是以对数坐标(纵坐标)表示试样浓度，用算术坐标(横坐标)表示实验鱼的存活百分数，然后将实验结果标在图上。并将0％存活率上下二点连成直线，直线与50％存活直线相交，再从交点引一垂线至浓度坐标，即为TLm值。根据24、48和96h的实验数据，可分别得到24TLm、48 TLm和96TLm。例如，根据表12-9实验数据作图后可得24 TLm为6.7 mg/L、48TLm为4.7 mg/L和96 TLm为3.56 mg/L。

表12-9 某毒物实验结果

3)鱼类毒性实验结果的实际应用鱼类毒性实验的重要目的是推导毒物的安全浓度。用TLm推导安全浓度的公式有多种，其中的两种可表示为：

按公式推导得到鱼类生存安全浓度后，要进一步做验证实验，特别是具有挥发性和不稳定性毒物时，应当用恒流装置进行长时间的验证实验,96 h内不发生死亡或中毒的浓度往往不能代表鱼类长期生活在被污染水体的安全或无毒浓度。验证实验是以推导所得的安全浓度水溶液饲养实验鱼一个月或几个月，并设对照组进行比较，如发现有中毒症状，则应降低浓度再实验。

鱼类毒性实验所得安全浓度可作为土壤浸出液毒性物质的最高允许浓度的依据之一，可作为农田排水安全性的一种参考检定法。

相关链接：污染土壤生物毒性评价（一）