采用化学键合固定相的液相色谱法简称为键合相色谱(bonded—phase chromatogra一phy．BPC)。键合相色谱的保留机制目前还没有一个定论，但从实际结果推测，吸附作用和分配作用兼而有之。

化学键合固定相要比采用物理涂渍固定液获得的固定相稳定得多，配用灵敏的检测器，可降低最低检测量；通过改变键合到载体表面有机物分子的结构和官能团，可改变固定相的选择性；由于有机分子是键合到载体上，因而耐溶剂冲洗，耐高温，没有固定液的流失，提高了色谱柱的使用寿命和稳定性；有机分子与载体表面的键合结构，消除或掩盖了表面活性吸附点，使表面性质均匀，耐高压，提高了色谱峰的对称性,消除了与活性吸附点存在的有关影响。键合相色谱法的这些优点使其迅速发展成为HPLC方法的主流类型。

1．正相色谱法

正相色谱的保留机理类似于吸附过程。正相键合相色谱法使用的是强极性的键合固定相和非极性或弱极性的流动相，适合于分离极性化合物以及异构体等。常用的色谱柱有氰基柱、硅胶柱、二醇基柱和氨基柱。柱型的改变对正相键合色谱选择性有一定的影响。碱性化合物与氰基柱对比易于在氨基和二醇基柱上保留，而偶极化合物在氰基柱上具有更强保留，这些色谱柱的选择性具有很大差异。

在正相分离中，通常氰基柱是首选，硅胶柱适合于异构体的分离或有机可溶性化合物的制备回收。二醇柱和氨基柱稳定性较差，通常在样品于氰基柱上无法分离时才采用。至于色谱柱的尺寸，以25cm xO.46cm柱为多选。正相流动相的配制，一般选择一种较弱(非极性)的溶剂与一种较强(极性)的溶剂，然后按某种比例混合获得。
当选好强溶剂和弱溶剂之后，可以通过混合使样品组分达到合适的保留值。

2．反相色谱法

反相键合相色谱法是采用极性较小的键合固定相和极性较强的流动相，它适用于分离广极性范围的试样，包括分离多环芳烃、氨基酸等极性化合物。近年来，反相键合相色谱应用极为广泛。本方法的优点是柱效高，谱峰基本上无拖尾现象。

反相色谱是目前液相色谱分离模式中应用最为广泛的一种分离分析模式。这是因为在流动相组成改变的情况下，有机强溶剂能够迅速在固定相表面达到平衡，因此特别适合于梯度洗脱。另外，在反相色谱中，溶质在固定相上的保留是基于分子问的非特异性疏水相互作用，由于所有的有机化合物分子都存在疏水基，因此反相色谱成为理想的、普遍适用的分析方法。

反相色谱的键合相使用烃基键合相，应用最多的是十八烷基键合硅烷，通常称为ODS固定相或C18柱。样品保留值主要由色谱柱的三个特性决定，即色谱柱型、键合相浓度和固定相表面积。保留值依不同键合相的性质而有所不同，并且通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大。例如，C₁₈柱上的保留值通常略大于C₈柱上的保留值。

色谱柱型的改变不仅可以导致选择性变化，也会改变样品巾不同组分的保留值。但应注意，为改变选择性和分离效果，改变色谱柱通常不如改变流动相类型方便和效果好。因此，只有在改变溶剂强度或溶剂选择性仍不能达到分离要求时，才尝试改变色谱柱类型。改变柱型后，必须重新进行流动相优化，研究表明，氰基、苯基、C₈、C₁₈等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C₈、C₁₈柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱。

反相色谱的流动相使用极性溶剂及其混合物，常用的有水、乙腈、甲醇、乙醇、丁醇、四氢呋喃及水一乙腈、水一甲醇、水一四氢呋喃等。选择流动相时，应考虑：①如以水为流动相，极性小的溶质组分保留值较大；②如以二元混合溶剂为流动相，极性小的溶质组分保留值随非极性溶剂浓度的增加而减小；③在含水流动相中，加入中性盐(如Na₂SO₄)会增加非极性溶质组分的保留值。另外，一些可解离的溶质组分的保留值也可用调节pH值的办法来使之增大。