化学键合相色谱法是由液液分配色谱法发展起来的。分配色谱法虽有较好的分离效果，但在分离过程，由于固定液的流失也使分配色谱法不适用于梯度洗脱操作。

为了解决固定液的流失问题，人们将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相，并进而发展成键合相色谱法。

化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，特别适用于具有宽范围k'值的样品的分离，并可用于梯度洗脱操作。

(一)键合固定相的分类

根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法(包括近年发展起来的亲水作用色谱)和反相键合相色谱法。

1.正相键合固定相

在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。
在正相键合相色谱法中使用的是极性键合固定相。它是将全多孔(或表面多孔)微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再与含有氨基(-NH₂)、氰基(-CN)、醚基(-O-)的硅烷化试剂反应，生成表面具有氨基、氰基、醚基的极性固定相。

2．反相键合固定相

在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更广泛。据统计在高效液相色谱法中，70％～80％的分析任务皆由反相键合相色谱法来完成。

在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔(或表面多孔)微粒硅胶载体，经酸活化处理后与含烷基链(C₄、G₈、C₁₈)或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相。

最常使用的反相键合固定相为十八烷基-硅胶固定相，俗称ODS。

反相键合相的分离机理认为溶质在固定相上的保留是疏溶剂作用的结果。根据疏溶剂理论，当溶质分子进入极性流动相后，即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子：当溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶质分子的非极性部分(或非极性分子)会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合配合物，构成单分子吸附层。这种疏溶剂的斥力作用是可逆的，当流动相极性减少时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并将溶质分子释放而被洗脱下来。上述疏溶剂作用机制可如图9-41所示。

图9-41  反相色谱中固定相表面上溶质
分子与烷基键合相之间的缔合作用
1-溶剂膜；2-非极性烷基键合相；
3-溶质分子的极性官能团部分；
4-溶质分子的非极性部分

在化学键合固定相中已键合上的官能团，将剩余的硅羟基屏蔽，形成所谓“刷子”的结构。如图9-42所示，为减少硅经基的吸附作用，还需对硅羟基进行封尾处理。

图9-42  化学键合固定相的“刷子”结构
1-已键合官能团的链长；
2-已键合官能团的端基

常用的化学键合固定相的类型和应用范围见表9-14。

表9-14  化学键合固定相的类型及应用范围

相关链接：液固色谱法和液液色谱法（六）