分光光度法误差来源主要有方法误差、仪器误差、操作误差。

1．方法误差

方法误差是指分光光度法本身所产生的误差。误差主要由溶液偏离比尔定律及溶液中干扰物质影响所引起。

(1)显色体系偏离比尔定律分光光度法的理论基础是朗伯一比尔定律：A=kcb

但在工作中常会碰到工作曲线发生弯曲的现象。大多是由于化学变化(如缔合、离解、溶剂化及形成新的配合物等)所引起的，使有色溶液的浓度与被测物的总浓度不成正比。

分光光度法测量依据光吸收定律的导出有三个假设条件，其中两个是稀溶液、均匀介质。因为假设吸光质点间无相互影响和相互作用，光线通过溶液时除选择性吸收外、无损失，而实际上当c>0.01mol/L时，邻近吸光质点彼此电荷分布相互受影响，加上吸光质点间离解、缔合、凝聚、配合物生成，发生化学变化均影响吸光质点的吸收效应；显色溶液中存在胶体、悬浮物、水中颗粒物质，使入射光线因散射而损失，从而引入误差，偏离光吸收定律。

(2)显色条件的变化显色反应的选择，关系到方法的灵敏度、准确度。通常用于分光光度法的显色反应应符合下述条件，灵敏度。在10⁴mol/(L·cm)以上，对比度|λ^MR_max-λ^M_max|至少在60nm上(对比度系指试剂与金属离子所成配合物的最大吸收波长与试剂最大吸收波长之差)；选择性要高即干扰离子要少；另外，生成的有色螯合物组成应恒定，性质要稳定，显色条件易控制。因为分光光度显色剂大多为有机螯合剂，显色条件决定了配合物平衡及稳定性。显色条件中最重要的是介质酸度，它影响显色剂的离解程度和显色反应的完全程度。其次是显色温度、显色时间、显色剂用量、显色介质，均应考虑进行优化。显色反应多是分步进行，反应条件的改变，都会引起有色配合物的组成发生变化，从而使溶液颜色的深浅度发生变化，因而产生误差。

2．仪器误差

仪器误差是指由使用分光光度计所引入的误差。

光吸收定律假设条件之一是入射光为单色光。单色光纯度由分光光度计质量决定，如在光度计规格中标示，单色光纯度260nm处优于0.2nm，杂散光200nm<1％或＜0.2％。由于单色器分光本领限制以及狭缝必须有足够宽度，因此只能得到一定波长范围的单色光，加上光学元件缺陷，杂散光的影响也不可忽略。

(1)仪器的非理想性引起的误差复色光引起对比尔定律的偏离；波长标度尺未作校正时引起光谱测量的误差，吸光度测量受吸光度标度尺的误差影响。

(2)仪器噪声的影响光度测定的准确度和精密度受仪器噪声的限制，测量样品的吸光度要经过测T=0％, T=100％及样品的T三个步骤。三步噪声的总和即为T测量的总噪声，它由光源强度、电子元件、光电管等的噪声决定。

(3)反射和散射的影响由于样品溶液和参比溶液的折射率不同，会引起反射损失不同。待测溶液浑浊，入射光通过时会产生散射效应。这些非吸收作用都会引起测定结果产生误差。

(4)吸收池引起的误差吸收池不匹配或吸收池透光面不平行，吸收池定位不确定或吸收池对光方向不同，均会使其透光率产生差异，使测定结果产生误差。因此配好对的吸收池应在毛玻璃面上用铅笔标记放置的方向。同时吸收池的洗涤也很重要，应按操作方法认真清洗。

(5)电子部件的影响光敏元件老化、光源不稳、波长不准、仪器读数误差、光源电压波动等均带来仪器误差。

3．操作误差

由于操作者知识、经验、操作水平的不同，即使用同一分光光度法，同一台分光光度计，也会在同一样品分析中引入不同误差，主要有以下几个方面。

(1)标准曲线绘制除应采用回归法并对其线性检验外，标准液配制与分取等分析化学基本操作的正确也十分重要。

(2)显色条件控制前面提到的多个显色条件均要求操作者按操作步骤控制好，否则将偏离正确的分析结果。

(3)仪器的读数误差。一般分光光度计透光度T，读数误差△T为0.2％～2％。实际上分光光度计读数的刻度标尺的各段读数误差是不同的。图5-20表明只有当待测吸光物质溶液浓度控制在适当范围内，由仪器测量引起的相对误差△c/c才比较小，当T=36.8％, A=0.434,△c/c相对误差达到最小值。实际分析中透光度T应控制在65％～15％，吸光度A控制在0.2～0.8范围。

图5-20一吸光度(A)曲线

相关链接：可见光吸收光谱法测定条件的选择