可见光分光光度法可以定量测定单一组分或多组分。测定单一组分可使用标准工作曲线法、示差分光光度法；测定多组分可使用求解联立方程式法、双波长分光光度法和导数分光光度法。

一、单一组分测定

1．标准工作曲线法

对于单一组分的测定，工作曲线法是实际工作中用得最多的一种定量方法。

工作曲线的制作方法为：配制4个以上浓度或适当比例的待测成分标准溶液，以空白溶液为参比溶液，在选定的波长下，分别测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。

在测定样品时按同样方法制备待测样品溶液，测定其吸光度，在工作曲线上即可查出待出物的浓度。待测物浓度应在工作曲线范围内。图5-14为工作曲线。

图5-14工作曲线

在一定条件下，工作曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。

工作曲线可以用一元线性方程表示：y=a＋bx

式中，x 为标准溶液的浓度；y为相应的吸光度。

使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a、b称为回归系数。

b是直线的斜率，可由下式求得：

式中，、分别为x和y的平均值；x_i为第i个点的标准溶液的浓度；y_i为第i个点的吸光度(以下相同)。

a为直线的截距，可由下式求得：

可以用相关系数来表示线性关系的好坏。相关系数r的定义为：

相关系数越接近于1线性关系越好。一般的光度分析方法r＞0.999。

工作曲线应定期校准。当条件有变动时，例如仪器经过修理、更换光源、更换标准溶液、试剂(如显色剂)重新配，都应重新制作工作曲线。

2．示差分光光度法

示差分光光度法又称差示分光光度法，简称示差法，是经典分光光度法的基础上派生出来的一种分光光度法。它是利用接近样品试液浓度(稍低或稍高)的参比溶液来调节分光光度计的0％和100％透射比以进行光度测量的方法。

在一般光度测定中，吸光度值在0.2～0.8范围之内，读数误差较小，但有时由于待测组分含量过高或过低，尽管采取了其它措施，如改变试样称样量、改变稀释倍数等，仍不能满足上述要求，为提高分析的准确度和精密度，可以采用示差分光光度法。

(1)示差分光光度法原理示差法是用一已知浓度的标准溶液作为参比溶液，测量未知溶液与已知标准溶液的相对吸光度A相对，求出未知液浓度的方法。

根据朗伯一比尔定律可以推导出：

A_相对＝εb(c_s-c_x)

式中，c_s为标准溶液浓度；c_x为未知溶液浓度。

A_相对值的大小与标准溶液的浓度差成正比。示差法的定量方法以标准曲线法和标准加入法应用较多。

(2)操作方法示差法中按照使用一份或两份参比溶液以及参比溶液浓度高于或低于待测溶液不同，将操作方法分为以下4种。

①高吸光度法分光光度计检测器未受光照时，调节透射比为0％，用一个浓度稍低于待测溶液的参比溶液调节透射比为100％。测定时，待测溶液的透射比会落入误差符合要求的范围内(图5-15)。从图5-15(a)可见，此法相当于刻度标尺放大了，因而测量的准确度相应增高。

②低吸光度法使用两种参比溶液，以空白溶液(蒸馏水、纯溶剂或试剂空白)调节透射比100％，以浓度稍高于待测溶液的参比溶液调节透射比为0％，使待测溶液的透射比落入误差符合要求的范围，见图5-15(b)。

③最高精密示差法以一个浓度较待测溶液稍低的参比溶液调节透射比为100％，以另一个浓度稍高的参比溶液调节透射比为0％。如果选择合适，待测溶液的吸光度值可以控制在A =0.4343左右，浓度测量的相对标准偏差最小，见图5-15 (c)。

这三种方法都相当于标尺扩展作用。

④全示差光度测量法规定以某一特定值的反向微电流i向左(透射比为0％一端)扩展一恒定值，再用另一参比标准溶液调节透射比为100％，以实现在标尺左右两个方向上放大标尺的目的，收到最高精密示差法的效果，我国已有定型仪器供应。

(3)示差分光光度法对仪器和实验条件的要求

①对仪器的要求仪器必须具有光源发出的光束通过一定吸收物质后仍能调节透射比100％的能力。因此必须配备强的光源、色散性能好的单色器及足够稳定的电子系统。

图5-15示差测量法标尺扩展示意图
(a)高吸光度示差法；(b)低吸光度示差法；(c)最高精密示差法

②对吸收池要求吸收池要严格配对，必要时进行校正。

③温度控制制作校正曲线和测量样品时，温度必须控制在±2℃范围内。若精度要求更高，应有恒温装置。