振动光谱解析主要依靠对光谱与化学结构关系的理解，灵活运用基团频率及影响其变迁的规律，与指认谱带归属的经验资料联系起来，逐步推出化合物的结构，与其他光谱方法比较，振动光谱的解析更带有经验性，解析时可参照如下程序。

(1)了解样品的来源。了解样品的来源、背景，测定其熔点或沸点，经元素分析，分子量测定，推出分子式，计算不饱和数，这些数据都能提供一定的结构信息。

(2)检查谱图质量。注意制样方法对谱图的影响，排除制样过程中由于引入水分、C02、硅胶等可能出现的“假谱带”，注意识别倍频、合频提供的信息及其对基频的干扰。

(3)考察1300cm2以上基团振动频率区的特征谱带。振动光谱的4000～1300cm的区域通常被称为“官能团区”。进行谱图解析时，主要对“官能团区”进行分析。主要官能团，如OH，NH和C=0等的特征吸收出现在光谱的“官能团区”。在各种官能团的特征区域若没有对应的吸收，则常可以作为在此分子中不含有这些基团的证据。
但是，必须注意，某些结构特征可以使谱带变弱变宽，而有可能观察不到。例如，在烯醇式的乙酰丙酮中，分子内氢键产生宽而弱的OH谱带，而有可能被忽略。

在红外光谱中，这些特征谱带大多源于键的伸缩振动吸收，容易指认其归属，再与其他频率区的相关谱带进行对照，可以推断分子结构类型和存在的相应官能团。在拉曼光谱中，可特别关注红外光谱中只是弱吸收的如一c—s一、一s—s一．一N=N一和一c=c一等官能团特征谱带及其在指纹区所提供更全面的信息。

(4)光谱中l300cm²的区域通常被称为“指纹区”。各种分子在这个区域内的吸收都是独特的，从而具有指纹性。大都由复杂的相互作用的振动吸收所产生，主要用于有机化合物的对照品(或标准)红外和拉曼光谱比较鉴别。

(5)确定以官能团为主的结构单元，比较简单的分子也可能写出结构式。

(6)研究各种影响因素对谱带引起的位移。对化合物的结构作进一步的分析，如确定为酮类化合物，当V2红外吸收谱带低于1700cm²时应为d，B一不饱和酮、芳香酮或羰基参与形成氢键。而当H2红外吸收高于l720μm时，则或者羰基的n一位有强吸电子取代基，或者为结构具有张力的五元环及五元环以下的环酮。一般甲基的对称变形振动在1375cm2附近出现较弱的吸收谱带，如这个谱带出现在1370cm2以下，而且强度增强为中等吸收，可能推测为与羰基相联的甲基，而出现在1400cm²以上的甲基对称变形振动谱带则应估计甲基与氮或氧相连。

对归属不明确的谱带应试探改变测试方法，或与化学反应相配合，反复考察求得确证。如用红外光谱确证化合物是否含羟基，可改用石蜡糊法或配成CCl2稀溶液测试，亦可用氘代法观察v2变为v1的位移。为证实羧基，也可形成盐，观察离子吸收谱带

(7)与标准谱图核对。振动光谱是很复杂的，一般化合物结构很难仅凭红外或拉下，改变盐浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为K。盐析，常用于蛋白质的粗提；②在一定的离子强度下，改变溶液pH及温度达到沉淀的目的，称为口盐析，常用于蛋白质的精制和纯化。

盐析沉淀的机理见图20一1。从图可见，盐析机理可归纳为如下三点：①中性盐在溶解时，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②中性盐在溶解后，盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③中性盐在溶解过程中，盐离子引起原本在蛋白质分子周嗣有序排列的水分子的极化，使水活度降低。

不同蛋白质对盐析的影响反映在cohn方程中就是对卢和K2的影响。不同蛋白质的卢值不同；K2值随蛋白质相对分子质量的增大或分子不对称性的增强而增大，即盐析沉淀结构不对称的高相对分子质量蛋白质所需的盐浓度较低。对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。

在实际工作中，常采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质，以达到分离目的。但是，有时候各种具有不同的卢和K。值的蛋白质混杂在某一体系中，若欲从该体系中分离纯化各蛋白质就不是那么容易了，必须组合采取K；盐析、届盐析和二次盐析的方法予以解决。

3．等电点沉淀

较低离子强度的溶液中蛋白质的溶解度较小，蛋白质在pH为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度最低的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀法。

等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质(如酪蛋白)，而对于亲水性很强的蛋白质(如明胶)，由于在水中溶解度较大，在等电点的pH下不易产生沉淀。虽然等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛，但与盐析法相比，等电点沉淀无需后继的脱盐操作，可直接转入后续的纯化阶段。

等电点沉淀操作需在低离子强度下调整溶液pH至等电点使蛋白质沉淀，由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故等电点沉淀操作中，多通过加入盐酸、磷酸和硫酸等无机酸调节pH。

4．有机溶剂沉淀

用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。有机溶剂沉淀是指在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂，显著地减小蛋白质的溶解度而发生沉淀的现象。有机溶剂沉淀法常适用于蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的提取。由于本法的机理和盐析法不同，可作为盐析法的补充。

有机溶剂沉淀是由于加入有机溶剂于蛋白质溶液中能产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质发生沉淀。尤其是水的活度的降低，当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大；同时在憎水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使该区域在有机溶剂中的溶解度提高，发生聚集而沉淀。

一般来说，在低离子强度和等电点附近，沉淀易于生成，所需有机溶剂的量较少。蛋白质的分子量越大，有机溶剂沉淀越容易，所需加入的有机溶剂量也越少。与盐析法相比，有机溶剂密度较低，易于沉淀分离，沉淀产品不需脱盐处理。但该法和等电点沉淀一样容易引起蛋白质变性，必须在低温下进行。

例如，多糖类药物主要来源于动物、植物、微生物和海洋生物，可分为低聚糖、均多糖和杂多糖等j种。目前，动物来源的肝素、鲨鱼骨黏多糖、甲壳素、硫酸软骨素和透明质酸等杂多糖仍主要是从动物材料中提取、纯化获得，提取时主要采用碱解和酶解方法，而多糖纯化则可采用乙醇分级沉淀、季铵盐络合沉淀和离子交换层析等方法。

5．选择性热变性沉淀

在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质问热稳定性的差别进行蛋白质的选择性热变性沉淀，来分离纯化热稳定性高的目标产物。

必须强调的是，选择性热变性沉淀是一种变性分离法，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解才可。

6．凝聚技术

凝聚是指在中性盐的作用下，由于双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象。胶粒保持分散状态的主要原因有：①由于带有相同的电荷和扩散双电层的结构。

②由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层，阻碍了胶粒问的直接聚集。但一旦∈电位降低，水化层也随之减弱。加入高价阳离子导致凝聚作用的原因是降低《电位和脱除了胶粒表面的水化膜，从而导致凝聚现象的发生。

7．絮凝技术

絮凝是指在某些水溶性高分子絮凝剂的存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理集合为主的过程。其机理是通过静电引力、范德瓦尔斯力和氢键力的作用，使水溶性高分子聚合物强烈地吸附在胶粒表面，产生了架桥连接，生成粗大的絮团。

常用絮凝剂有聚丙烯酰胺衍生物、苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂、天然有机高分子絮凝剂等。其中天然有机高分子絮凝剂主要有明胶、海藻酸钠、骨胶、壳聚糖等。

聚电解质对蛋白质的沉淀作用机理与絮凝作用类似，同时还兼有一些盐析和降低水化用，其缺点是易使蛋白质发生改变。

8．沉淀技术的组合应用

不管是盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性变性沉淀法，还是等电点沉淀法，各种方法都有局限性。在实际应用时，多种沉淀方法相结合是一个发展方向。如前文所述的结合等电点沉淀和有机溶剂沉淀的方法制备酪蛋白就是很好的例子。