1.实验方法的选择

最简单的荧光分析方法是直接测定法。针对本身发荧光的被分析物质，可以通过激发和发射光谱的确定和检测其荧光强度来确定其浓度．如果有其他干扰物质存在，则应事先采用掩蔽或分离的办法加以消除。

间接测试的方法通常是针对那些本身不发荧光的物质或者其内源荧光较弱、量子产率低的物质而采取的，可以借助荧光猝灭、荧光衍生或能量转移三种方法。其中第一种荧光猝灭法是指被测物本身不发光，但却能使某发光物的荧光猝灭，根据猝灭程度(荧光强度的降低)与被测物浓度关系进行间接测定。如果借助某种手段使本身不具备发光性能的物质转化为能发荧光的衍生物，再通过测定该衍生物的荧光光谱进行间接测定待分析物质，这种方法是荧光衍生法。例如，借助金属离子配位作用形成发荧光的配合物，或者将不发光的有机物通过化学反应转化为荧光物质。第三种情况是借助能量受体进行检测。这是针对不发荧光的待测物质，可以添加某种可作为能量受体的荧光试剂，通过能量转移使被分析物分子的激发电子经单重态一单重态(或三重态一单重态)将激发能量传递给受体，进而使受体分子电子被激发，最后通过测定受体所发射的发射光谱，根据其荧光强度的变化对被分析物进行间接测定^[1,2]。

除了普通荧光分析法外，还有相分辨荧光、时间分辨荧光、三维荧光、导数荧光、同步荧光测定法以及化学计量学等方法，来达到分别或同时测定的目的。三维荧光光谱能同时获得激发与发射波长变化时的荧光强度信息。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，即为三维荧光光谱。普通荧光分析所测得的激发光谱和发射光谱都是二维谱图。但是，实际上荧光强度是激发和发射这两个波长变量的函数。固体表面荧光测试方法有两种：一是直接测定固体物质表面的荧光；另一种是将待测组分吸附在固体物质表面进行测定。能够采用的固体载体有氧化铝、硅胶、溴化钾、乙酸钠、硅酮橡胶、滤纸、纤维素、蔗糖等。测定形式也有两种：一为反射式，二为透射式。采用反射式时，激发光源和检测器应该在样品的同一边，互呈45^o角。激发光照射在样品表面发射出的荧光经单色器散射后由检测器检测。如果采用透射式则需要将将样品吸附在透明的物质(一般为薄层色谱板)上，激发光源和检测器分处在样品的两边。紫外激发光经滤光片除去可见光，照射在样品斑点上而发射荧光，该荧光透过基底的薄层板再经单色器散射后由检测器检测^[1,2]。

2.实验条件的选择及选择依据

实验条件的选择直接决定样品测试结果的准确度。样品的吸光度和测试时样品的几何排列与样品的荧光强度和谱带的分布有关。通常，选择入射光与样品池呈直角的方式，以确保样品中心发光。此外，还有前表面型和偏离中心型的几何排列法，这些方法通常用于测试大吸光度或者大浊度的样品。前表面型测试是指入射光与样品呈45^o角的排列。但是该排列法有如下缺点：反射光进入发射单色器的杂散光多，干扰测量。有研究人员建议采用30^o角的前表面法，这样可减少进入发射单色器的反射光，同时增大样品的光照面，这样就可减少样品位置的敏感性，但是同时也带来了因照射面积大而降低测量的灵敏度。也有人建议如果样品的浓度和厚度不太大，最好采用后表面发光型，这样几乎可以完全排除发射光进入发射单色器的可能性。有些时候，当样品的吸光度较大，则其荧光光谱和荧光强度会出现失真现象；用前表面发光测量高浓度的荧光样品时也会有失真现象。但是，前表面型测量的发光强度与样品浓度无关，入射光会被液体池的近表面全部吸收。

3.实验影响因素及其排除办法

任何仪器分析和测试都要考虑其影响因素，荧光分析也不例外。例如，在测试溶液的荧光光谱时，干扰发射谱带的有溶剂的散射光(拉曼散射和瑞利散射)和胶粒的散射光(丁铎尔效应)，同时也要考虑容器表面的散射光的影响。散射光的干扰会限制荧光灵敏度的提高，因而实际操作中一定要注意加以克服。除了拉曼散射外，上述散射光均具有和样品激发光一致的波长。拉曼散射的波长比激发波长稍长，早会以一定的频率差随激发波长的变化而改变。为此，可以选择适当的激发波长和测定波长来降低或排除散射光的干扰。当被测量物质的荧光强度较弱时，可以采用加大狭缝宽度的方法来获得足够的荧光强度测量值。但狭缝加大后透过的散射光也会增大，对测量的影响也将加大，因此实际测定时一定要选择合适的狭缝宽度。当然，通过空白测定，也可对散射光的影响进行校正。

下面介绍几种影响荧光光谱及其强度的因素及相应的解决办法^[1,2]。虽然发光体发光的能力主要取决于其分子结构，然而测试的环境因素尤其是溶剂介质对分子荧光会产生很大的影响。只有很好地了解和利用这些因素，才能找到提高灵敏度和选择性的途径。

1).溶剂性质的影响

由于溶质与不同溶剂分子之间静电作用存在差异，溶质分子的基态和激发态的偶极矩和极化率也存在差异，这些差异性导致溶质与溶剂分子之间的作用程度也不同，从而使同一化合物在不同溶剂中的荧光光谱和强度可能不同。这些因素对荧光光谱位置和强度会产生很大影响。芳香环上含有极性取代基的化合物的荧光光谱最易受溶剂的影响。溶剂的影响还有一般和特殊的溶剂效应之分。溶剂的介电常数和折射率的影响属于一般溶剂效应；而后者是指被测荧光化合物和溶剂分子之间的特殊相互作用，如键合或者形成氢键的作用。前者普遍存在，而后者则与溶剂和荧光物质的化学结构有关。后者所引起的发射光谱的位置移动通常比一般的溶剂效应引起的大。除了这些溶剂效应外，有些荧光物质因自身化学结构会随溶剂极性的改变而改变，如形成分子内的电荷转移态或者扭转的分子内电荷转移态，等等。因此，在做荧光分析测试时应选择合适的溶剂。

2).溶液酸碱性的影响

溶液酸碱性的变化会对本身是一种有机弱酸或弱碱的荧光物质的光谱形状和强度产生较大影响。这是因为该弱酸或弱碱的分子及其相应的离子各自具有不同的荧光特性，在不同酸碱性的溶液中荧光物质不同型体的比例会发生改变，进而影响测试结果。荧光实验操作时，可通过调节溶液的pH来产生所要求的某种型体，该型体的荧光光谱移动后能够与干扰组分的荧光光谱分离开来，从而达到提高选择性的目的。

3).测试温度的影响

温度对于溶液的荧光光谱有很大的影响。通常随着温度的降低，荧光强度和荧光量子产率会增大。而进行荧光测定时，由于光源的温度相当高，极易引起被测溶液的温度升高，有时室温也可能发生变化，所以经常会导致荧光强度的变化，因此样品室的温度在测定过程中应尽可能保持恒定。

4)．重原子效应

还有一类溶剂效应与溶剂的极性和溶剂的氢键性质无关，但是也能对溶质的荧光强度和磷光强度产生影响，而几乎不影响其跃迁的频率。这类溶剂效应是由于溶剂分子中含有高原子序数的原子造成的，被称为外重原子效应。有时芳香化合物分子中的重原子取代基团也会引起荧光强度减弱、磷光强度增强的现象，这一类重原子效应被称为内重原子效应。

5)．有序介质的影响

有些有序介质对发光物质的发光特性也会有显著的影响，例如，表面活性剂或环糊精溶液，它们在发光分析中有着广泛的应用。通常表面活性剂是非光活性物质，使用方便、毒性小，其胶束溶液光学上透明、稳定，对发光物质起着增溶、增敏和增稳的作用。实践证明，利用表面活性剂作为介质是提高荧光分析法灵敏度和选择性的有效途径之一。例如，在荧光测试中环糊精类化合物应用广泛，这是因为该类物质分子结构存在亲水的外缘和疏水的空腔，许多有机物分子能和这个疏水的空腔结合形成主客体包合物。

6)．其他溶质的影响

有机分子的荧光除了会受溶剂效应的影响，有时也会因为其他溶质的作用而受到影响。如金属离子与芳香族配体配位之后会对配体的荧光光谱和强度产生影响。如果荧光体与溶液中其他溶质发生了能量转移、化学反应、电荷转移或碰撞作用等过程也可能导致荧光体的荧光猝灭现象，等等。

4.对被测样品的要求

荧光化合物是指具有大的共轭体系和刚性的平面结构，具有能发射荧光的内在本质的化合物。如果被检测体系自身含有荧光团而具有内源荧光，就可以通过检测内源荧光的某种荧光参数的变化来研究该体系的性质，这时采用的是直接测定法。而如果所要研究的体系本身不含有荧光团，或者其内源荧光很弱，这时就需要在体系中外加一种荧光化合物(即荧光探针)，通过测量探针的荧光特性的变化来研究体系的性质，这种方法是间接测定法。

5.样品的制备要求

1)．固体样品

将样品充分干燥并研磨成粉末，用称量纸移至样品槽内，用药匙压平，使槽内充满粉末即可。

2).溶液样品

首先配好一定浓度的溶液，将溶液小心转移到比色皿内，然后将比色皿放在支架上，再一起放入样品槽内，即可准备测试。