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有害物质的毒理学研究方法

发布时间:2017-12-07 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1542

环境质量的恶化,不管起因是物质因素,还是能量因素,测定这些因素的量或其他理化数据是环境监测的重要内容。但是单凭理化数据,是难以对环境质量作出准确评价的。因为环境是一个复杂的体系,污染物种类繁多且含量多变,各种污染因素之间存在拮抗和相加、相乘作用。环境综合质量很难以各污染物个别影响来评价。利用生物在该环境中的反应,确定环境的综合质量,无疑是理想的和重要的手段。本节仅介绍环境毒理学的研究方法,它通过用实验动物对污染物进行毒性试验,确定污染物的毒性和剂量的关系,找出毒性作用的阈剂量(或阈浓度),为制定该物质在环境中的最高允许浓度提供资料;为防治污染提供科学依据;也是判断环境质量的一种方法。例如,有些有机合成化工厂,其排放废水成分复杂,有微量的原料、溶剂、中间体和产品等,它们性质又不稳定,因此,要分别测定这些物质和确定主要有害因素往往很困难,甚至不能做到。但如果用鱼类做毒性试验,并指定一个反映这些污染物的综合指标(如化学需氧量),那么确定该废水的毒性和剂量是比较容易实现的。

一、实验动物的选择及毒性试验分类

(一)实验动物的选择

实验动物的选择应根据不同的要求来决定,同时还要考虑动物的来源、经济价值和饲养管理等方面的因素。国内外常用的动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗等。鱼类有鲢鱼、草鱼和金鱼等。金鱼对某些毒物较敏感,特别是室内饲养方便,鱼苗易得,为国内外所普遍采用。需要指出的是,实验动物必须标准化,因为不同品种、年龄、性别、生长条件的动物对毒物的敏感程度是不同的。

不同的动物对毒物的反应并不一致。例如,苯在家兔身上所产生的血象变化和人很相似(白细胞减少及造血器官发育不全),而在狗身上却出现完全不同的反应(白细胞增多及脾淋巴结节增殖)。又如,苯胺及其衍生物的毒性作用可导致变性血红蛋白出现,它在豚鼠、猫和狗身上可引起与人类似的变化,但在家兔身上却不容易引起变性血红蛋白的出现,而对小白鼠则完全不产生变性血红蛋白。要判断某种物质在环境中的最高允许浓度,除了根据它的毒性外,还要考虑感官性状、稳定性及自净过程(地表水)等因素。另外,根据对实验动物的毒性试验所得到的毒物的毒性大小、安全浓度和半数致死浓度等数据也不能直接推断到人体,还要进行流行病学调查研究才能反映人体受影响情况。当然,实验动物的毒性试验无疑是极为重要的。

(二)毒性试验分类

毒性试验可分为急性毒性试验、亚急性毒性试验、慢性毒性试验和终生毒性试验等。

1.急性毒性试验

一次(或几次)投给实验动物较大剂量的毒物,观察其在短期内(一般为24h到两周以内)的中毒反应。

急性毒性试验由于变化因子少、时间短、经济及操作容易,所以被广泛采用。

2.亚急性毒性试验

一般用半数致死量的1/20~1/5,每天投毒,连续半个月到三个月左右,主要了解该毒物毒性是否有积累作用和耐受性。

3.慢性毒性试验

用较低剂量进行三个月到一年的投毒,观察病理、生理、生化反应,寻找中毒一诊断指标,并为制定最大允许浓度提供科学依据。

(三)污染物的毒性作用剂量

污染物的毒性作用剂量可用下列方式表示(见表4-10)。

表4-10污染物的毒性作用剂量

由表4-10可以看出,污染物的毒性和剂量关系可用下列指标区分:半数致死量(浓度),简称LD50 (LC50);最小致死量(浓度),简称MLD(MLC);绝对致死量(浓度),简称LD100(LC100);最大耐受量(浓度),简称MTD (MTC)。

半数致死量(浓度)是评价毒物毒性的主要指标之一。由于其他毒性指标波动较大,所以评价相对毒性常以半数致死量(浓度)为依据。在鱼类、水生植物、植物毒性试验中也可采用半数存活浓度(或中间耐受限度、半数耐受限度等,简称TLm)。

半数致死量的计算方法很多,这里介绍一种简便方法—曲线法,它是根据一般毒物的死亡曲线多为“s”形而提出来的。取若干组(每组至少10只)实验动物进行试验,在试验条件下,有一组全部存活,一组全部死亡,其他各组有不同的死亡率,以横坐标表示投毒剂量,纵坐标表示死亡率。根据试验结果在图上作点,连成曲线,在纵坐标死亡率50%处引出一水平线交于曲线,干交点作水平线的垂线交于横坐标,其所对应的剂量(浓度)即为半数致死量(浓度)。举例说明:将表4-11中的死亡率与投毒剂量绘成曲线,得到半数致死量为39 mg/kg,根据表4-12急性毒性分级表可以判断该物质为高毒。

表4-11用某毒物给小鼠一次灌胃中毒死亡情况

表4-12急性毒性分级表

按染毒方式不同,毒性试验可分为吸入染毒试验、皮肤染毒试验、口服毒性试验及注入投毒试验等。

二、吸入染毒试验

对于气体或挥发性液体,通常是经呼吸道侵入机体而引起中毒。因此,在研究车间和环境空气中有害物质的毒性及最高允许浓度时,需要用吸入染毒试验。

(一)吸入染毒法的种类

吸入染毒法主要有动态染毒法和静态染毒法两种。此外,还有单个口罩吸入法、喷雾染毒法和现场模拟染毒法等。

1.动态染毒法

将实验动物放在染毒柜内,连续不断地将由受检毒物和新鲜空气配制成一定浓度的混合气体通入染毒柜,并排出等量的污染空气,形成一个稳定的、动态平衡的染毒环境。此法常用于慢性毒性试验。

2.静态染毒法

在一个密闭容器(或称染毒柜)内,加入一定量受检毒物(气体或挥发性液体),使其均匀分布在染毒柜,经呼吸道侵入实验动物体内,由于静态染毒法是在密闭容器内进行,实验动物呼吸过程消耗氧,并排出二氧化碳,使染毒柜内氧的含量随染毒时间的延长而降低,故而只适宜做急性毒性试验。在吸入染毒期间,要求氧的含量不低于19%(体积分数),二氧化碳含量不超过1.7%(体积分数)。所以,10只小鼠的染毒柜的容积需要60 L。染毒柜一般分为柜体、发毒装置和气体混匀装置三部分。柜体要有出入口、毒物加入孔、气体采样孔和气体混匀装置的孔口。发毒装置随毒物的物理性质而异,最常用的方法是将挥发性的受检毒物滴在纱布条、滤纸上或放在表面皿内,再用电吹风吹,使其挥发并均匀分布。对于气态毒物,可在染毒柜两端接两个橡皮囊,一个是空的,另一个加入毒气。按计算浓度将毒气橡皮囊中的毒气压入染毒柜,另一个橡皮囊即鼓起,再压回原橡皮囊,如此反复多次,即可混匀。也可直接将毒气按计算浓度压入,借电风扇混匀。

(二)吸入染毒法的注意事项

实验动物应挑选健康、成年并同龄的动物,雌雄各半。以小白鼠为例,应选用年龄为两个月,质量为20 g左右的小白鼠,太大、太小均不适宜。每组10只,取若干组用不同浓度进行试验,要求一组在试验条件下全部存活,一组全部死亡,其他各组有不同的死亡率,然后求出半数致死浓度(LC50),对未死动物取出后继续观察7~14d,了解其恢复或发展状况,对死亡动物(必要时对未死动物)作病理形态学检验。

三、口服毒性试验

对于非气态毒物,可采用经消化管染毒的口服毒性试验进行测定。

(一)口服染毒法的种类

口服染毒法可分为饲喂法和灌胃法两种。

1.饲喂法

将毒物混入动物饲料或饮用水中,为保证动物吃完,一般在早上将毒物混在少量动物喜欢吃的饲料中,待吃完后再继续喂饲料和水。饲喂法符合白然生理条件,但剂量较难控制精确。

2.灌胃法

此法是将毒物配制成一定浓度的液体或糊状物。对于水溶性物质可用水配制,粉状物用淀粉糊调匀。所用注射器的针头是用较粗的8号或9号针头,将针头磨成光滑的椭圆形,并使之微弯曲。灌胃时用左手捉住小白鼠,尽量使之成垂直体位。右手持已吸取毒物的注射器及针头导管,使针头导管弯曲面向腹侧,从口腔正中沿咽喉壁慢慢插入,切勿偏斜。如遇阻力应稍向后退再缓缓前进。一般插入2.5~4.0 cm即可达胃内。

(二)注意事项

灌胃法中将注射器向外抽气时,如无气体抽出说明已在胃中,即可将试验液推入小白鼠胃内,然后将针头拔出。如注射器抽出大量气泡说明已进入肺或气管,应拔出重插。如果注入后小白鼠迅速死亡,很可能是穿入胸腔或肺内。小白鼠一次灌胃注入量为其质量的2%~3%,最好不超过0.5 mL(以1 g/mL计)。

四、鱼类毒性试验

在自然水域中,鱼类如能正常生活,说明水体比较清洁;当有毒工业废水排入水体,常常引起大批鱼的死亡或消失(回避)。因此,鱼类毒性试验是检测成分复杂的工业废水和废物浸出液的综合毒性的有效方法。

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