植物的遗传转化技术研究一直方兴未艾，许多转基因技术不断被发明，虽然这些技术的可靠性和稳定性，甚至科学性均有待提高和明确，但这些技术的研究和建立也是植物转基因技术不断发展的动力源泉。下面简单对一些植物转基因方法或技术进行介绍。

一、电激法

(一)电激法的概念和特点

电激法(也称为电击穿孔法)是20年代80年代初发展起来的一种遗传转化技术。该方法主要原理是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”，细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，借此可以导入外源DNA, RNA、蛋白质、病毒颗粒等多种生物大分子以及核苷酸和染料等多种小分子。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果。我国科学家李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的转化，现在这一方法已被应用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。电激法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便、转化效率较高、特别适于瞬时表达的特点。缺点是造成原生质体的损伤，且仪器也较昂贵。近年来对电激法的应用又有新发展，通过电激法直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，然后将外源基因直接导入植物细胞，已在水稻上获得转基因植株。使用该技术可以不制备原生质体，提高了植物细胞的存活率，而且简便易行。

(二)电激转化技术的主要步骤(以小麦幼胚电激转化为例)

1．植物材料

大田小麦开花授粉12～15d后，将其穗子剪下并放在70％乙醇中浸泡约1min，无菌水洗3次或4次，然后剥出幼胚待用。

2．电激转化

将幼胚用升汞灭菌后放入HPES-3电激仪的电激小室中进行电激。每个小室装有100uL的Hepes电激缓冲液(内含目的基因或大片段DNA)和约20个幼胚。参照电激仪的电激参数(如脉冲数Np=2⁷、脉冲强度Td=62us、电压Vp=10000V、循环数N_c=15、循环间隔时间T_r=1s，放电针尖至液面距离h=3～5mm，长脉冲输出方式)进行电击。

3．转化材料的选择培养与再生

将电激转化的幼胚先放在无选择剂的愈伤组织诱导培养基上培养3d。然后转入含有选择剂的培养基中进行选择与继代培养，继代时间10～14d, 25～28℃于黑暗中。经选择培养而存活下来的愈伤组织被转至再生培养基中，16001x光强下培养，每天光照16h。当再生的小植株大于2cm高时，再转至N₆培养基进行生根壮苗培养。

二、PEG转化法

(一)PEG转化法的特点

PEG法最早用于植物原生质体融合研究，1982年Kren首次用于转化研究，其作用是在二价阳离子存在下促进原生质体对外源DNA的吸收，同时还保护外源DNA免受核酸酶的降解。

PEG法最早用于水稻遗传转化并获得转基因水稻植株。原理是将植物原生质体悬于含质粒DNA的PEG中，由于渗透压的作用，质粒DNA透过原生质体膜进入细胞内，随机地整合到水稻的基因组中，经原生质体再生成完整植株。此法需要的设备简单，易于操作。但原生质体的分离和植株再生费时、费力，后代变异大，且受再生的基因型限制。

(二)PEG转化的技术主要步骤(以PEG转化水稻为例)

1．胚性悬浮细胞系的建立

水稻成熟胚在固体培养基上诱导出愈伤组织，经多次继代后，选出颜色淡黄、由松散小颗粒组成的胚性愈伤组织转移到AA液体培养基中。在90r/min的播床上暗培养(27℃),每周继代培养1次，建立起水稻胚性悬浮细胞系。

2．原生质体游离及纯化

将获得的悬浮细胞加入含有分解细胞壁结构的混合酶液中，27℃下暗培育4h。悬浮有原生质体的混合酶液依次通过孔径为40um和20um的尼龙网。离心收集原生质体并用洗涤液洗涤1次。

3. PEG转化

原生质体悬浮于转化介质中，加入质粒DNA形成混合液。该混合液在室温下培育15min后，加入40％的PEG6000溶液，使PEG的终浓度为25％。再在室温下静置15min后加入终止溶液停止PEG处理，并用该终止溶液洗涤3次或4次彻底去除PEG。最后用原生质体培养基洗涤1次并将原生质体以2×10⁵个／mL的密度悬浮于该培养基中。

4．原生质体培养

悬浮有原生质体的液体培养基与预先溶化的2％低溶点琼脂糖培养基等量混合，使琼脂糖的最终浓度为1％和原生质体的接种密度为10⁵个／mL。而后迅速将混合液滴到60mm×15mm的培养皿中。在琼脂糖珠完全冷却并固定在培养皿底部后，每皿再加入2mL液体培养基，使液体完全铺满皿底而又不淹没琼脂糖珠顶部。在液体培养基中加入少量悬浮细胞(每皿50～100mg)作为看护细胞。培养皿封口后置于黑暗、27℃下培养。

原生质体培养10d后，将看护细胞洗掉，更换液体培养基。15d后可以看到小细胞团产生。此时用含选择剂的液体培养基完全替代原来的培养基以筛选转化体。

三、花粉管通道法

花粉管通道法(pollen-tube pathway)是由周光宇等(1978)建立并在长期科学研究中发展起来的，是利用花粉管通道法将外源DNA导入受体的技术。这一技术原理可以应用于任何开花植物。目前，通过这一技术已培育出多种植物的新材料并已推广应用。

(一)花粉管通道法的原理

花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法转化的实质是受精过程转化。花粉粒在柱头上萌发形成花粉管，不断向胚囊伸长，滴注在柱头上的外源DNA随着花粉管进入胚囊，卵细胞近合点处无细胞壁而仅有膜，花粉管放入胚囊的核 DNA遗传物质开始附在核膜上。然后断裂分散，并与卵核DNA融合，在胚发育的初期，即原胚期间的细胞无厚的细胞壁，而具有很强的分裂能力，并从胚囊中吸取营养物质，这时外源DNA被吸入这些细胞，参与核的融合。

(二)花粉管通道法的研究进展

花粉管通道法于1974年由周光宇设计，1978年首先由周光宇等对小麦、水稻和棉花进行外源DNA导入时使用，这些研究都得到了变异子代。这一技术同其他转基因技术相比具有简单、方便、育种时间短、任何基因源都可用来基因转化，并可直接运用到常规育种等优点。1983年周光宇等在Method in Enzymology上报道了棉花通过花粉管通道法导入外源DNA获得成功的文章。1988年Luo等用花粉管道通法将含报告基因的质粒DNA转入水稻，经Southern杂交和酶学鉴定，都得到了转基因植株。1991年谢道听等利用花粉管通道法将苏云金芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽培水稻品种‘中花11号’获得了转基因植株。花粉管通道法已经在多种作物中获得了成功，确定了其在基因转移中的地位。

中国农业科学院作物科学研究所自1978年以来提取大米草、高粱、玉米、紫色稻等的DNA，采用胚直接注射法和花粉管通道技术将DNA导入水稻都获得了具有供体植物特异性状的子代或特殊变异的新类型。段晓岗和陈善葆(1985)以具有正常绿色组织的水稻品种‘京引1号’为受体，在该水稻自发授粉后2～3d进行注射，将供体叶子和颖壳都是紫色的一个水稻品种的总DNA溶液滴于切去花柱的切口，获得了紫色性状超过80％的种子。Luo和Wu(1988)用切割柱头滴加法得到54粒种子，这些种子经分子杂交检测筛选10株为转化子，证实了外源DNA已整合到水稻基因组中，转化率达20％。

近年来花粉管通道法发展迅速。同时，我们也应该看到花粉管通道法作为一种转基因技术自20世纪70年代末开始应用于农作物的种质创新和新品种选育，虽然至今学术界对此方法尚存争议，但由于这种转基因技术不需要昂贵的仪器设备和组织培养技术，又不受克隆基因数量的限制，转化率显著高于其他转基因技术，还可以转移多基因控制的数量性状，20多年来在水稻、小麦、棉花、大豆等作物上都获得了成功，这也证明了这一技术的可行性。

(三)花粉管通道法转基因技术的主要步骤(以大豆的花粉管导入法为例)

1．导入的时间

选择大豆开花的盛花期。早上7:00以后的任何时间均可导入，但为防止滴于柱头的DNA液滴过快蒸发，最好避开中午11:00～14:00的暴晒时期。注意，如果露水过大或滴完DNA液后3～4h即下雨，则不宜导入，否则会影响导入转化率。

2．花蕾大小的选择

选择花冠高于最高花萼0.5～1.0mm的、颜色鲜艳的花蕾。如果花蕾颜色暗淡，虽然花冠尚未开放，但往往是旗瓣萎缩，花冠高度与最高花萼的距离无法估算，此时打开花瓣可以看出花粉和柱头均比鲜艳花蕾的暗淡，说明该种花蕾已经自花授粉完毕或处于授粉末期，选择这样的花蕾易造成导入转化率的降低，既浪费时间、人力，又浪费DNA提取液。

3．导入方法

导入方法分为切部分柱头与不切柱头两种。多数采用切部分柱头的方法。首先将标准花蕾周围的花去掉，用尖镊子分开旗瓣，轻轻夹掉冀瓣和龙骨瓣(保留旗瓣，以托住DNA液滴并防止过快蒸发)，此时打开龙骨瓣根本看不到柱头，当把包围于柱头的雄蕊去掉后，柱头上的花粉粒也随之掉落，露出球形柱头，此时可采取剔、剜、切三种方式实现切掉部分柱头。第一种，刀片(一定要锋利)延花柱向上，剔除部分柱头；第二种，用刀尖将微微弯曲抵在花蕾内侧的柱头剜除一部分；第三种，用未拿刀的一只手的拇指托住弯曲的柱头，沿与花柱成30^o～60^o角度准确切除部分柱头。然后挂牌，标明日期，最后滴DNA液于柱头。

四、激光微束穿刺法

利用激光微束穿刺法将外源基因导入植物细胞，因具有操作简单、定位准确、对细胞损伤小以及外植体适用性广泛而受到重视。

(一)激光微束穿刺法导入外源基因的机理

子叶细胞在高渗液中浸泡一定时间后，细胞内外会形成一个渗透压梯度，内高外低，用激光微束进行细胞膜穿孔，外源DNA便通过直径2～3 nm的穿刺孔顺着渗透压梯度进入细胞内，在很短时间内，细胞穿孔自然闭合，而进入细胞内的外源DNA便随机整合到植物组DNA上，PCR检测外源基因可稳定表达。这种方法适合于多种植物及其不同的幼嫩器官、悬浮细胞和愈伤组织等，尤其对单子叶植物的外源基因导入十分有用。

(二)激光微束穿刺法转基因的发展概况

近年来随着激光微束技术的发展，使人们开始考虑用聚焦到微米级的激光微束给组织穿刺，从而导入外源DNA。这一设想首先在动物和人的细胞中试验并取得了成功，如Tsuka-koshi已成功地将GFP基因导入大鼠肾细胞。研究证明激光微束导入技术操作简便、转化频率高、外源基因整合到细胞基因组上的频率可达9×10^-3，为一般PEG的100倍。在1987年第七届国际原生质体学术讨论会上Weber报告了用微束激光单脉冲照射油菜细胞，将外源DNA定向导入叶绿体、线粒体等细胞器中，其操作简便、转化频率高等特点引起了世界上这一领域科学家的极大兴趣。但以此方法获得外源DNA稳定表达的转基因植物在国外未见报道。

Weber (1988)用紫外激光对双苯甲胺标记的DNA转化细胞，证明外源DNA可被微束激光导入植物细胞。翌年进一步证实微束激光可定向穿透细胞壁与细胞膜、并将外源基因定向导入细胞器。近年来，王兰岚等在激光微束转化方面做了大量工作，并在世界上率先得到了有分子证据的稳定转化植株。他们采用激光微束穿刺法将外源基因导入小麦、百脉根、油菜、苹果等植物成功地获得转基因植株。利用微束激光将新霉素磷酸转移酶基因导入小麦幼胚，并使该基因得到了稳定表达。

从总体来看，本方法可以应用于多种植物，操作简便，对细胞的损伤小，可准确定位于被照射的细胞，实验重复性好。尽管如此，该体系还有许多需要进一步完善的地方，包括技术体系的完善和激光微束作用机理的理论研究。

(三)激光穿刺转化法(以油菜为例)

激光微束穿刺前将材料进行预处理。将油菜子叶柄浸泡于高渗培养液中预处理30min,迅速用液体培养基冲洗材料并用滤纸吸干。

置于事先加入2～5ug质粒DNA的Rose小室中，在与激光微束仪相连的相差显微镜(10x物镜，12.5×目镜)下连续扫描照射，每个小室打6000～8000个脉冲。照射后的子叶块接种于不含选择剂的MS培养基上培养2～4d后，转至含选择剂的MS筛选培养基上。有些子叶块在切口等边缘处出现突起，逐渐出现愈伤组织，在筛选培养基上培养约40d便分化出绿芽点，随后绿芽点分化成芽丛，这说明外源DNA通过微束激光的穿刺小孔转化到这些组织块细胞内，并整合到基因组中，使植物细胞可能具有抗生素抗性。绿芽丛逐渐分化出小苗，将这些小苗移至生根培养基。