已发表的植物转基因操作体系有十余种。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法和基因枪介导的转基因方法。

根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批能表达外源基因的转基因植物就是利用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的200多种转基因植物中，80％以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法所产生的。

一、根癌农杆菌的研究简史

许多双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，这个名称是因肿瘤着生在近地面的根茎交界处，第二节根癌农杆菌介导的植物转基因已发表的植物转基因操作体系有十余种。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法和基因枪介导的转基因方法。

根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批能表达外源基因的转基因植物就是利用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的200多种转基因植物中，80％以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法所产生的。

一、根癌农杆菌的研究简史

许多双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，这个名称是因肿瘤着生在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名(图10-1)。Smith和Townsent (1907)首先发现植物冠瘿瘤是由农杆菌诱发的。35年后，Braun等(1942)进一步研究冠瘿瘤与农杆菌的关系，发现农杆菌的不同菌株诱发不同的肿瘤，有的菌株不能诱发肿瘤。由于冠瘿瘤组织能在不加植物生长激素的培养基上无限生长，也不需要农杆菌的存在，因而人们对农杆菌诱发肿瘤的说法产生了怀疑。于是，Braun提出了“肿瘤诱导因子”假说，即推测农杆菌中存在一种染色体外遗传因子。20世纪60年代，Movel等研究发现，植物肿瘤组织中含有高浓度的特殊氨基酸，最常见的是章鱼碱和胭脂碱，总称为冠瘿碱(opines)。Petit等证明了肿瘤组织合成的冠瘿碱种类取决于农杆菌菌株的种类，而与宿主植物无关；而且这些菌株能专性地利用肿瘤组织合成的不同类型的冠瘿碱作为菌株生存的唯一碳源和氮源。这一结果为肿瘤诱导因子假说提供了有力的证据。Petit等进一步推测细菌携带的遗传因子进入了植物细胞，并认为这种遗传因子既能诱发肿瘤，又可决定肿瘤的形态和冠瘿碱的合成。Zeanen等(1974)和Van Larebeke等(1974)从致瘤农杆菌中分离出一类巨大质粒，称为致瘤质粒(tumor-inducing plasmid) ,简称Ti质粒。并研究发现凡丢失Ti质粒，农杆菌的致瘤能力则完全丧失，从而证明Ti质粒就是Braun假说中的肿瘤诱导因子。此后一系列研究结果进一步证明了冠瘿瘤的产生、冠瘿碱的合成和其他一些功能都是由Ti质粒携带的遗传信息决定的。Chilton等(1977;1978)利用分子杂交技术证明植物肿瘤细胞中存在一段外来DNA，它与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，称为转移DNA (transferredDNA)，简称T-DNA。T-DNA内部有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。有关根瘤农杆菌Ti质粒的结构与功能、Ti质粒的改造和载体构建见其他章节。

图10-1农杆菌侵染伤口的模式

二、植物转基因研究中常用的农杆菌菌株及特性

常用的农杆菌菌株及其特性归纳于表10-1。一般来说，染色体背景为C58的菌株生长速率快、不结球，在转化实验中易于操作；染色体背景为Ach5的菌株生长慢，菌株培养过程中结球，在转化实验中难于操作，其培养后不易洗掉。

表10-1常用的农杆菌菌株

三、农杆菌转化的机理

当农杆菌在生长培养基上大量繁殖时，所有的T区基因均处于非转录活性状态。当把植物受伤细胞提取液加入培养基时，所有的T区基因均被诱导和活化。所以，植物细胞分泌物(糖、氨基酸和酚类物质等)既是农杆菌定向附着到植物细胞表面的物质，也能诱导和启动毒性区基因的表达，为T-DNA的转运做准备。

Vir区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后，首先是VirA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白。VirA蛋白分子分成5段：第一段在N端，处于细胞质中；第二段及第四段均为疏水的跨膜α螺旋；第三段在细菌的基质区；第五段则是很长的一段C端胞质域。VirA蛋白可直接对植物产生的酚类化合物感应，感应位点定位于第四段。当酚类物质(如乙酰丁香酮)与感应位点结合后，会使整个VirA蛋白构象发生变化，其C端活化。C端有激酶的功能，使蛋白质上的组氨酸残基发生磷酸化，从而激活VirA蛋白。被激活的VirA蛋白可以转移其磷酸基团至VirG蛋白，使VirG蛋白活化。

Vi rG编码DNA结合活化蛋白。Vi rG基因有两个启动子：第一个启动子对磷酸饥饿敏感，受磷酸缺乏的诱导；第二个启动子可被强烈的pH变化、DNA损伤及重金属离子等因素所诱导。从总体上讲，VirG基因属组成型表达。当VirG蛋白活化后，以二聚体或多聚体形式结合到Vir启动子的特定区域，从而成为其他vir基因转录的激活因子，打开Vi rB等基因簇(图10-2)。

引起农杆菌趋化反应和诱导Vir基因表达的酚类物质是植物抗毒素和木质素合成的基本成分，因此，有人认为农杆菌在侵染植物的过程中破坏了植物自身的防卫机制。

遗传作图的分析表明，T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，它可插入任何一条植物染色体。但插入位点常有以下特点：①优先整合到转录活跃的植物基因位点；②T-DNA与植物DNA连接处富含A, T碱基对；③植物DNA上的插入位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。

图10-2农杆菌侵染植物的过程

四、农杆菌T-DNA转移的影响因素

(一)农杆菌菌株

由于农杆菌染色体基因的作用直接影响T -DNA转移的效率，不同的农杆菌菌株有不同的宿主范围，并有其特异侵染的最适宿主。不同类型的农杆菌菌株的毒力(侵染力)不同。一般而言，三类农杆菌菌株的侵染力的排列顺序为：农杆碱型(琥珀碱型)菌株(如A281)＞胭脂碱型菌株(C58)＞章鱼碱型菌株(Achy, LBA4404)。选择适宜的转化菌株对植物转基因工作来说非常重要。

(二)农杆菌菌株高侵染活力的生长时期

高侵染活力的菌株一般处在对数生长期，即0.3 ～1.8 OD₆₀₀ ，1.0 OD≈1×10⁹cell/mL。一般用0.3～1.0 OD₆₀₀浓度的农杆菌菌液侵染植物材料。

(三)基因活化的诱导物

Vir区基因的活化是农杆菌Ti质粒转移的先决条件。前面谈到酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿和低pH都影响Vir区基因的活化。在操作过程中，最常用的诱导物是乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮(HO-AS)，但AS效果更佳。关于诱导剂的使用有三种方法：①在农杆菌菌液培养时加入诱导剂的时间一般是制备工程菌侵染液4～6 h前，也有在农杆菌制成侵染液时加入；②加在共培养基中；③在农杆菌液体培养基和共培养基中都加，AS的使用浓度一般为5～200umol/L,培养基的pH为5.1～5.7、共培养温度为15～25℃, D-半乳糖酸的浓度为100umol/L,葡萄糖酸的浓度为10mmol/L、葡萄糖的浓度为10mmol/L,磷酸根的浓度为0～0.1mmol/L。

(四)外植体的类型和生理状态

1997年Villemont通过研究指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短时期内，只有处于细胞分裂S期(DNA合成期)的细胞才具有被外源基因转化的能力。因此，细胞具有分裂能力是转化的基本条件。发育早期的组织，如分生组织、维管束形成层组织、薄壁组织以及胚、雌配子和雄配子体等，这些组织的细胞具有很强的分裂能力。当这些组织发生创伤或环境诱导时加速分裂，即处于转化的敏感期。已经分化的组织细胞的转化能力与其发育程度有重要关系。一般来说，发育早期(幼年期)的组织细胞转化能力较强，这已被大量的实验结果所验证。

(五)外植体的预培养

外植体的预培养与外植体的转化有明显关系，每种外植体均有其最佳预培养时间，时间太长反而降低外植体的转化率。一般以2～3d为宜。一般认为，外植体的预培养有以下作用：①促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源DNA的状态；②田间取材的外植体通过预培养的驯化作用，使外植体适应于试管离体培养的条件；③有利于外植体与培养基平整接触。因为外植体在开始培养过程中由于其迅速生长而出现上翘和卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌生长受抑制而不能实现对受体的转化。

(六)外植体的接种及共培养

外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。常用的方法是将外植体浸泡在预先准备好的工程菌株中，浸泡一定时间后，用无菌吸水纸吸干，然后置于共培养培养基进行共培养。共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程。外植体的接种时间和接种农杆菌菌液的浓度因物种和外植体的类型不同而不同。接种时间过长及接种菌液浓度过高容易引起培养物的污染。而接种时间太短和接种菌液浓度过低又造成转化效率低。一般接种时间为1～30min，接种菌液浓度为0.3～1.5 OD₆₀₀，具体数据见表10-2。

表10-2不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度

农杆菌与外植体共培养在整个转化过程中是非常重要的环节，因为农杆菌的附着、T-DNA的转移和整合都在这个时期内完成，因此，掌握共培养技术和条件是转化成功的关键。前面己谈到，农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化，只有在创伤部位生存8～16h之后的菌株才能诱发肿瘤。因此，共培养时间必须长于8～16h。但共培养时间不宜太长，否则，可能会由于农杆菌的过度生长而使植物细胞受到毒害而死亡。一般共培养时间为2～3d。大多数研究者使用相同的培养基悬浮菌液和共培养，且多采用低盐培养基。多数共培养基中加入AS和单糖类化学诱导物，并加入较高量的生长素类(如2,4-D)激素，而避免使用细胞分裂素类(如BA和TDZ)激素，因为生长素类激素能促进T-DNA的转移，细胞分裂素激素抑制T-DNA的转移。有关生长素的作用也有相反结果的报道。