农杆菌介导的遗传转化已成为目前植物基因工程中应用最为普遍的转化策略。前面已经讲过，农杆菌之所以可以介导基因发生转移主要就是依赖于农杆菌质粒的存在。随着研究的深入，人们对它们的认识也越来越清楚：农杆菌质粒是农杆菌染色体以外的遗传物质，是一种天然的能实现DNA转移和整合的系统。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒在结构上很多相似之处：首先，它们都是双股共价闭合的环状DNA；其次，它们都属于巨大质粒，其中Ti质粒有150～200kb, Ri质粒有200～800kb；再次，它们都有两个与致瘤有关的区域，即毒性区(Vir区，编码能够实现T-DNA转移的蛋白质)和可转移DNA区(T-DNA，能够插入到植物基因组中并能够稳定表达的区域，位于该区的致癌基因与肿瘤的形成有关)。下面分别介绍Ti质粒和Ri质粒的结构和功能。

一、根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能

迄今为止，研究人员从不同植物中已分离出不同种类的农杆菌，对它们的Ti质粒结构特性也有深入研究。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以分为以下4种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agro-pine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称为琥珀碱型(succinamopine)。章鱼碱和胭脂碱是由氨基酸衍生的冠瘿碱，而农杆碱和农杆菌素碱是属于单糖衍生的冠瘿碱。通过Ti质粒DNA的限制性内切核酸酶图谱和基因图谱，目前已经清楚地了解到不同类型的Ti质粒上的基因分布、结构和功能。研究发现，各种不同类型的Ti质粒都具有控制肿瘤诱发的且物理位置彼此相邻的T-DNA区和毒性区(Vir区)，它们约占Ti质粒DNA总长度的1/3。 Ti质粒其余部分包括：①含复制起点(origion, ori)的复制区( replication region)，其基因编码的蛋白质调控Ti质粒的自我复制；②质粒接合转移位点(transf erby conjugation loci, con)，该区段上存在着与细菌间接合转移有关的基因(tra)，负责调控Ti质粒在农杆菌之间的转移；③对噬菌体P1的排他性基因(age)、细菌素84的敏感性基因(agr)和不相容性基因(incompatibility, inc)(图9-2)。

图9-2Ti质粒结构示意图

(一)T-DNA的结构特点及功能

T-DNA是以单拷贝或多拷贝的形式整合在植物的细胞核基因组中的，其长度占质粒DNA总长度的10％左右，但基因结构由于质粒类型的不同而有所不同。T-DNA区由癌基因(oncogene, one)和两端的边界序列(border sequence)两部分组成。胭脂碱T-DNA是一条大约23kb的连续DNA片段，两端各有一段25bp的重复序列[分别称为左边界序列(LB-DNA)和右边界序列(RB-DNA) ]，共编码13个基因。章鱼碱T-DNA的分子结构相对较复杂，通常由两条分离的T-DNA片段组成(TL-DNA区和TR-DNA区)，这两条分离的T-DNA片段各自带有相应的左边界序列和右边界序列。其中左端的T-DNA (TL-DNA)长约14kb，共携带8个基因，主要是控制冠瘿瘤形成的基因(包括章鱼碱合成酶和致瘤基因)；右端的T-DNA (TR-DNA)长约7kb，共编码5个基因，主要含有参与编码冠瘿碱生物合成的蛋白酶类基因(包括甘露碱和农瘿碱合成酶基因)，但是没有与冠瘿瘤维持相关的基因。章鱼碱T-DNA在结构上的这种复杂性可能是在最初整合后发生了重排、扩增和缺失的结果，但究竟有何种意义，迄今仍不清楚。

章鱼碱型和胭脂碱型的T-DNA区域上都有一段8～9kb长的DNA，称为核心区(或保守区)，其序列同源性可达90％。核心区主要包含一些onc基因及一些与冠瘿碱合成相关的两类基因。第一类是由8个基因组成的onc基因簇。在核心区上的iaaM, iaaH和ipt基因都属于诱发肿瘤的基因，且都与植物激素合成有关。其中iaaM和iaaH称为生长素基因(aux)，后来也被称为肿瘤形态茎芽基因(tumor morphology shoot, tms)。 iauM ( tms1)基因编码色氨酸单加氧酶，催化由色氨酸合成吲哚乙酸途径的第一步反应；iaaH (tms2)编码吲哚乙酰胺水解酶，催化由色氨酸合成吲哚乙酸途径的第二步反应，这两种酶一起合成吲哚乙酸；ipt基因编码异戊烯转移酶(isopentenyltransferase)，该酶利用异戊烯焦磷酸腺嘌呤合成细胞分裂素的前体，是细胞分裂素生物合成途径的第一步反应，也被称为肿瘤形态学根基因(tumor morphology shoot, tmr)。T-DNA通过同时控制生长素和细胞分裂素的合成破坏了植物体内正常的激素平衡，最终导致转化植物组织中无规则肿瘤的形成。第二类是冠瘿碱合成相关的基因，这些基因在不同类型Ti质粒上的分布是不同的。胭脂碱型有两个基因，一个位于T -DNA右端，编码胭脂碱合成酶(nopaline synthase, nos)；另一个位于T-DNA左端，编码农杆菌素碱合成酶(agrocinopine systhase, acs)。章鱼碱型含有四个冠瘿碱合成基因，一个位于TL-DNA右端，编码章鱼碱合成酶(octopine synthase, ocs) ,将色氨酸和丙酮转变成章鱼碱；另外三个基因位于TR-DNA的右端，编码农杆碱(agro-pine synthase, ags)和甘露碱合成酶(mannopine synthase, mas 1 ' and mas 2')。同时还发现，ocs基因和ncs基因的启动子在各种不同的植物细胞中都有功能活性，因此被广泛地运用于植物基因工程的载体构建。

除此之外，在章鱼碱TL-DNA上还带有一些具有其他功能的基因。例如，ORF-6b基因被称为肿瘤形态学膨大基因(tumor morphology large, tml)，对肿瘤生长速率具有调控作用。自发的缺失突变和转座子插入突变的研究结果证明，这些基因的失活不影响大多数宿主菌的致癌性，但对某些特定宿主植物的致瘤性是必要的。例如，从葡萄藤分离的菌株就与多数对广泛双子叶植物有诱导作用的农杆菌不同，它的肿瘤诱导宿主范围是有限的。这类具有特定宿主范围的菌株(LHR)在其TL-DNA区上的ipt基因失活时会扩大宿主范围，诱导肿瘤发生。研究表明在LHR菌中ORF- 6b基因影响ipt基因的活性，是对特定宿主植物的一个重要的致瘤基因。

T-DNA左右两个末端的25bp正向重复序列属于保守序列。胭脂碱T-DNA的LB序列为：TGGCAGGATATTGTGCTGTAAAC;RB序列为：TGACAGGATATATTGGCGGGTAAC；章鱼碱TL-DNA LB序列为：CGGCAGGATATATTCAATTGTAAAT; TL-DNARB序列为：TGGCAGGAATATACCGTTGTAATT。右边界核心部分有14bp，可分为10bp (CACGATATAT)及4bp (GTAA)两部分。可见，右边界序列更为保守，左边界序列在某些情况下会有变化。实验表明，左边界缺失突变仍能致瘤；右边界缺失则不再能致瘤，T-DNA的转移几乎完全没有发生，这说明右边界在T-DNA整合过程中比左边界要重要。此外，在章鱼碱型的T-DNA的右边约 17bp处有一个24bp的超驱动序列(overdrivesequence, OD序列，TAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTG)，是有效转移TL-DNA,TR-DNA所必需的，与转化效率有关，在胭脂碱型T-DNA边界上则未发现这一序列。如果去除该OD序列，则章鱼碱型农杆菌诱导肿瘤能力就会降低，所以该序列也被称为增强子(enhancer)。将其置于25bp边界序列6kb的上游，仍有促进T-DNA转移的作用，可以提高土壤农杆菌的致瘤性。除了保守的左、右边界外，T-DNA区域的其他基因和序列都与T-DNA转移无关，利用这一特点，我们在设计载体时可以用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因来去除致瘤基因，从而导致转化的植物细胞不再具有成瘤能力。利用这种改造的具有非致瘤性的卸甲载体(disarmed vector)，可以较容易地将目的基因转移到宿主细胞的染色体上，进而得到完整转基因植株。

(二)Vir区的结构特点和功能

Vir区上的基因与T-DNA能否转移到植物细胞的遗传过程有关，Vir区上的基因能够使农杆菌表现出毒性。Vir区总长度大约35kb，至少由6个互补群组成，分别命名为VirA,VirB, VirC, VirD, VirE, VirG。各个位点根据表达情况可以分为两种：一种是组成型表达，在无诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；另一种是植物诱导型表达，基因必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，即只有在植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达。

其中VirB, VirC, VirD和VirE为可诱导型表达；VirA和VirG为组成型表达，但VirG在受到植物受伤组织分泌的信号分子的诱导下，表达量可以提高10多倍，也具有植物诱导型表达特征。

1.VirA区

VirA区由单一基因组成，大小为2. 8kb，编码1个92kDa的多肽。VirA区编码一种结合在膜上的受体蛋白(sensor)，由周质结构域(periplasmic domain)、接头结构域(linker domain)、激酶结构域和接收器结构域(receiver domain)组成，以膜通道的形式存在，可能起ATP酶的作用，可用于通道组装和输出过程，帮助接受植物信号分子启动毒性区表达。VirA蛋白专一性富集在细菌内膜上。周质结构域位于细胞壁与细胞质之间的间隙中，与农杆菌染色体毒力(chromosomal virulence, chv)基因区段(11kb)编码的ChvE蛋白相互作用而起到感应外界信号的“天线”作用。VirA-ChvE结合后，可使接头结构域暴露出来而感受酚类及糖类化合物信号；其功能是帮助植物细胞接受植物信号分子，然后启动Vir区表达。

2. VirG区

VirG区具有单拷贝基因，大小为1. 2kb，编码30kDa的VirG蛋白(也称为DNA结合活化蛋白，DNA-binding activator protein)。当磷酸化的VirA蛋白将其磷酸集团转移到VirG蛋白上的第52位点的天冬氨酸残基上时，VirG蛋白被激活。VirG与VirA构成了一种双因子调控体系(two-component regulatory system)。VirA接受外界环境因子的信号，通过VirG对毒性区的其他基因进行正调节。VirG的调节方式有两种：①它的全诱导表达需要具备正常功能的完整VirA和VirG区存在；②在乙酰丁香酮存在时，在pH5. 5和磷酸饥饿诱导情况下，VirG可以高水平表达，即在植物受伤时VirG会以其产生的酸性环境条件为第二信号进行两步式的调节：首先VirG被低pH诱导提高细菌体内的VirG蛋白水平；然后在乙酰丁香酮作用下使VirG磷酸化转变成活性形式，从而进一步调节自身基因和其他毒性区基因的表达。

3. VirB区

不同类型Ti质粒的VirB区至少编码11个开放阅读框架(ORF)。根据胭脂碱型Ti质粒VirB区的11个ORF预测出来的蛋白质大小与实际观察到的蛋白质大小相近。章鱼碱型VirB区也有11个ORF，它们的核苷酸序列和胭脂碱型VirB区有很大的同源性，但编码区长度大小不同。每个ORF(除VirB 6以外)前方都有蛋白质翻译所需的Shine-Dalgarno(SD)序列。SD序列一般位于ATG起始密码子前方5～13个核苷酸处，是细菌核糖体的识别位点。5个VirB多肽编码区可能利用翻译偶联机制启动合成，即它们首先转录成1条大于9000个核苷酸的单链多顺反子转录子，当下游编码区的起始密码子靠近或者重叠相邻的上游编码区的终止密码子时，下游蛋白质的翻译依赖于相邻的上游蛋白质的翻译，核糖体结合到长链mRNA上，可以减少核酸降解系统的攻击。如果缺乏SD序列，这种偶联效应的能力将显著降低。

VirB区编码的蛋白质属于膜转运蛋白，N端带有信号或存在富含至少20个疏水氨基酸残基的疏水区，推测VirB蛋白的亚细胞定位就基于以上两个特性。胞质蛋白缺乏信号序列和疏水区；外周胞质蛋白带有N端信号序列，但无疏水区；内膜蛋白一般不含信号序列，但包含1到多个疏水区；外膜蛋白具有信号序列，但无明显的无间断疏水区。需要注意的是，这些推测是以α螺旋结构为基础，不适用于β折叠结构。同时内膜蛋白的拓扑学特性可以用“膜内阳性区”规则来推导，即跨膜蛋白面向胞质的区域通常富含带正电荷的氨基酸残基，带负电荷的氨基酸残基的分布情况不影响蛋白质的拓扑学特性。

VirB蛋白N端带有两种信号序列：一种是与细菌输出信号肽序列相似，具有共同的信号肽酶Ⅰ酶切位点，符合“Heijine-3，-1规则”，即酶切割位点的一1位点为丙氨酸或甘氨酸，-3位点则由丙氨酸、甘氨酸或其他小氨基酸组成；另一种是脂蛋白信号序列，被信号肽酶Ⅱ识别，切割位点的-1位是丙氨酸或甘氨酸，+1位由甘油化半胱氨酸占据。-2位或-3位的氨基酸决定了脂蛋白在内、外膜上的位置。若是负电荷氨基酸残基，则蛋白质位于内膜；若是不带电荷的氨基酸，则蛋白质位于外膜。可见VirB蛋白具有穿膜或跨膜相关的特性，所以可能具有改变细菌细胞膜结构的功能，从而产生一个膜穿透通道，使T-DNA转移到细菌细胞外。表9-1为Vi rB区中11个ORF所编码的蛋白质的特性和作用。

表9-1 VirB区编码蛋白的特性和作用

可见，VirB蛋白质既可能形成膜通道，也可能作为T-DNA复合物的组成成分。因为T-DNA复合物覆盖一层疏水蛋白对细菌和植物细胞膜与膜间的相互作用是非常有利的。

4. VirC区

VirC区与VirD区分享共同的转录调控区，但转录方向相反，其是毒性区各位点中唯一以逆时针方向转录的位点。它含有两个开放的阅读框架VirC1和VirC2，分别编码25kDa和22kDa的蛋白质。两个ORF间仅间隔两个核苷酸，前方都有与大肠杆菌核糖体结合位点同源的SD序列，VirC2就位于VirC1的编码区内，可见这两种蛋白质是翻译偶联的。

VirC可以和前面介绍的T-DNA末端序列外侧的超驱动(OD)序列结合，通过VirD操纵子在T-DNA末端序列负链特异性位点的缺刻式切割来实现。VirC1与超驱动序列的结合是需要经过毒性诱导才能进行的。目前尚不清楚VirC2的功能，通过VirC2突变子的分析，预测其也可能对T-DNA的转移作用有一定贡献。

5. VirD区

Vi rD区至少包括4个ORF (VirD1～4)，分别编码分子质量为16.2kDa, 47.4kDa,21.3kDa, 75.7kDa的4种蛋白质分子，均与T-DNA加工有关。

VirD1编码一个16. 2kDa的DNA松弛酶。与DNA拓扑异构酶工作用类似，它的作用是在DNA链上切割一个缺刻，使DNA解旋后再封闭，降低DNA超螺旋数目。该酶的作用不需要ATP参与，但催化反应必须在Mg²⁺的帮助下方可进行。

VirD2编码一个47. 2kDa的蛋白质，它具有切割T-DNA末端的能力，以及与T-DNA复合物共价结合后引导复合物向植物细胞核的方向运动的能力。VirD1和VirD2蛋白是T-DNA边界加工内切酶，在T-DNA上的特定位点切割形成缺口后，T-DNA链开始合成，形成T-DNA-VirD2复合物。

不同类型的农杆菌菌株之间VirD3蛋白的同源性很小，而且现在对其功能尚不清楚。

VirD4蛋白N端带有一段信号肽序列，对将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。VirD4的C端可能伸到内外膜之间的周质空间中，与一些尚未证实的膜蛋白相互结合。

6. VirE区

VirE包含两个基因VirE1和VirE2。VirE2编码60.5kDa的蛋白质，和ssDNA紧密结合，但不具有序列特异性。研究预测VirE2可能以共价的方式和T-DNA-VirD2复合物的T-DNA分子的5‘末端结合，形成T-复合物，以保护其免受核酸酶的降解作用，可能它们是在进入植物细胞时结合，然后借助VirE2导入植物细胞核内，最终整合到染色体基因组上。可见在T-复合物的形成中VirE2不是必需的，但是它对T-复合物的有效转移是必需的。VirE1蛋白确保VirE2蛋白的运输，但与T-DNA-VirD2复合物的运输无关。

7. VirF区

在章鱼碱型的Ti质粒中有一个VirF基因，但在胭脂碱型的Ti质粒中却没有。研究表明，VirE2和VirF是通过VirB转运通道被运输到植物细胞中，表明它们是在植物中起作用的，可以协助T-DNA转移到宿主植物细胞中。

8. VirH区

VirH区原名pinF区，在章鱼碱型农杆菌Ti质粒上有两个VirH基因，分别编码47.5kDa的蛋白质VirHI和46.7kDa的蛋白质VirH2。VirH1蛋白和VirH2蛋白的作用现在还不是研究得很清楚，根据对突变体的分析，认为它们可能对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用。

9. Tzs

Tzs为胭脂碱型农杆菌Ti质粒特有，编码与玉米素合成(trans-zeatin synthesis)有关的细胞分裂素异戊(间)二烯基转移酶产物，在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素被植物吸收后能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。

(三)Ti质粒的生物学功能

通过前面的介绍不难发现，农杆菌中的Ti质粒有一套非常完备能与植物细胞发生相互作用的系统：一方面，通过感染植物细胞，诱导产生能被Ti质粒所在的农杆菌作碳源和氮源的冠瘿碱；另一方面，诱导产生的冠瘿碱又起到了一种分子“激发剂”的作用，诱导与其接触的Ti质粒上编码控制接合转移和冠瘿碱分解代谢的基因的表达，从而激发Ti质粒转移到原先并没有存在这种质粒的土壤杆菌中去。

简单来讲，Ti质粒的功能可归纳为以下7个方面：为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；诱导寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸(IAA)和一些细胞分裂素；诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分；赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力；赋予寄主菌株对土壤杆菌素的反应性；决定寄主菌株的植物寄主范围；有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与繁殖，即具有对噬菌体的“排外性”。