一、反射技术及应用

1．镜反射

对于那些吸收特别强烈的物质或者不透明表面上的覆盖物(如中药或药物制剂等)可以用镜反射技术来获得它们的光谱。

当入射光射到被测样品上时，它不是透射，而是被样品表面反射进入接收器，从而获得样品的镜反射光谱。

镜反射方法中的红外反射吸收光谱法，又称之为掠角反射法((；IR)常被应用于药物的表面分析。

2．衰减全反射光谱

衰减全反射(Attenuatedtotalreflectance，ATR)，又叫内反射(Internalrelicflection)。全反射现象不完全是在两种介质的界面上进行的，部分光束要进入到样品介质一段距离后才反射同来，透人到样品介质的光束，在样品的透光区，反射光能几乎等于入射光能，而在样品的吸收区，则有部分入射光被吸收，“全反射”是衰减的，其衰减程度与样品的吸收系数的大小有关，因此扫描整个中红外区即可得到非常类似于通常的透光光谱，一般称为ATR光谱。

所以对于不同的ATR棱镜和不同的样品有着不同的临界角，要发生全反射首先要满足下面两条：一是只有光从光密介质进入光疏介质时才能发生全反射，即棱镜的折射率要大于样品的折射率；另一条是入射角要大于临界角。

由于一次反射能量的变化相当小，所得光谱的吸收谱带很弱，如果增加全反射的次数，即可使反射的吸收谱带增强，这就是多重衰减全反射(Multiple internalreflectance)，其装置多次衰减全反射是一种入射光多次透人样品层的结构。

入射在样品表面的光产生全内反射时，并非在样品表面立即产生反射，而是进入样品表面一段距离(称穿透深度)后，再返回样品表面，而后再反射出去。其穿透深度为：

λ1为光在内反射棱镜材料中的波长，它与入射光波长λ的关系是λ1=λ／n1；n1为内反射棱镜材料的折射率；θ为人射角(必须大于临界角)；n21为样品折射率n2与n1之比，即n21=n2／n1；dp为光透人样品的垂直深度，称穿透深度。

入射光进入全反射棱镜(常用溴化铊一碘化铊混晶或ZnSe材料制成)，样品与全反射棱镜紧密贴和。当入射角大于临界角时，入射光在透人样品一定深度后，会折回射人全反射棱镜中，多次反射，多次进入样品。进入样品的光，在样品有吸收的频率范围内光线会被样品吸收而强度衰减，在样品元吸收频率范围内光线被全部反射。因此对整个频率范围而言，由于样品的选择性吸收，使衰减全反射中的入射光能被部分衰减，除穿透深度外，其衰减的程度与样品的吸收系数有关，还与多次内反射中的光接触样品的次数有关。这种衰减程度在全反射光谱上就是它的吸收强度。

当仪器扫描时，不同波长的光就有不同值的穿透深度，波长短的光1λ值小，穿透深度如值就小，吸收示弱。而波长长的光λ1值大，穿透深度dP值就大，吸收示强。这就是全反射光谱的吸收强度分布的依据。

反射法光谱强度取决于穿透深度如，反射次数和样品与棱镜的紧密贴和情况及样品本身吸收的大小，而与样品用量无关。

3．漫反射光谱技术(简称DFIFT)

当光照射到疏松的固态样品的表面时，除有一部分被样品表面立即反射出来(称为镜反射光)之外，其余的入射光在样品表面产生漫射，或在样品微粒之间辗转反射逐渐衰减，或为穿人内层后再折回的散射。这些接触样品微粒表面后被漫反射或散射出来的光具有吸收一衰减特性，这就是漫反射产生光谱的基本原因。漫反射装置的作用就是最大强度地把这些漫射、散射出来的光能收聚起来送人检测器，使得到具有良好信噪比的光谱信号。因此，漫反射光谱是一种非常复杂的叠合信息，它包括样品表面的漫射和反射、样品内层的散射以及由散射效应引起的更复杂的信息。

漫反射装置有多种形式。典型的红外光谱仪的漫反射结构。由于漫反射方法是测定周体样品散射信息，所以对固体样品制样、测谱的一些基本原则也都适用。漫反射的空白光谱一般采用溴化钾或氯化钾细粉末样品。通常必须先测量和保存背景光谱，然后测量样品的光谱，再处理和扣除背景，得出样品光谱。

漫反射光谱制样要求固体粒度在10μm以下，如果粒度大，镜反射机会多，漫反射光能少，则吸收峰强度下降，半峰宽增加。这与压片法制样的透过光谱有明显差异。样品磨碎的粒度是非常重要的。

漫反射光谱除受粒度影响外，还受颜色影响。深色样品因强烈吸收入射光，故漫散射光能较少，使谱图吸收峰模糊不清，质量下降。但用傅立叶变换红外光谱仪可方便的测得药物原料及其剂制，或中药材及中成药等样品的光谱。漫反射附件装好后，它的样品处理比压片法简便，成功率高。

二、显微红外光谱法

显微红外光谱法就是将显微镜装在Fourier变换红外光谱仪上，是微量分析又是微区分析的近代技术。目前显微红外光谱技术已广泛应用于包括生物、药物等在内的许多领域。

1．红外显微镜原理和仪器结构

红外显微测试附件通常具有透射型和反射型两种测量功能。要将显微镜所必需的透红外材料加工成目镜、物镜等部件存在着加工难题，目前多数是采用镜面反射原理制作这些部件，称之为“红外透镜”，即cassegmin聚光镜。

需要作显微红外的试样置于溴化钾或氯化钠晶片上，晶片固定于载物台的中心iL里。该载物台可在上下、左右、前后三度空间任意移动，以校正焦距并选择欲摄图的区域。经试样吸收后的干涉光透过Cassegrain聚光镜进入碲镉汞检测器，该检测器处在液氮的低温状态以期降低噪声而获得较高检测灵敏度。所接收的信号经Fouri。。变换后即可得到常规频率域的红外光谱。

显微红外光谱的特点之一是灵敏度特别高，最高可达Pg级。一般数个ng的试样就可得到满意的光谱图。测量微小颗粒的截面积为10μm×10μm，最小可测到直径为5μm。特点之二是试样测定时放在晶片上，可保持原样不变，回收方便，以便可用于其他分析。

2．显微红外光谱的应用举例

显微红外光谱技术虽然处于初创时期，但它在化学领域、法医鉴别、医学研究等各个领域已取得了非凡的成效，解决了其他分析方法无法解决的难题，并显示了很大的潜在力量。以下介绍几种主要用途。

(1)有机化合物晶型混合物分析药物的多晶现象已经引起人们的注意和重视，例如驱虫药甲苯咪唑存在3种不同晶型，其中之一的疗效接近于零而另外两种的有效率为98％，因此晶型的检测显得十分重要。有时即使是在固定的溶剂等结晶条件下．所得晶体往往是两种或多种晶型的混合物。抗结核药利福定就存在这一长期未能解决的难题。显微红外光谱为分析多晶混合物提供了最有用的方法，它能在显微镜下逐粒地进行红外摄谱，从而获得混合物中各个单晶的晶型信息。

(2)医学及法学检验分析显微红外可测出晶片上单个细胞的红外光谱，从而进行某些疾病的诊断。例如曾用红外显微方法测定了白血病患者及正常人单个淋巴细胞的光谱，发现脱氧核糖核酸DNA的1080cm。处吸收峰面积与蛋白质的酰胺I在1540on“处的羰基吸收峰面积的比例，患者是正常人的5倍以上，这与白血病患者的白细胞增生较快的现象相符合。又例如在法医检验分析中，由于在刑事犯罪现场和道路交通事故现场等所能提取到的物证经常是极微量的，如一根几毫米长的纤维+一小片多层油漆碎片，一粒肉眼都难以看清楚的固体等，这是常规红外光谱难以解决的难题，

显微红外技术就可不损坏物证而进行检验分析，为案件的分析提供有力的物证。