世界上第一个被发现的抗生素是1948年从金色链丝菌中分离出来的，四环素类抗生素（tetracyclines）是一类在临床上广泛使用的具有菲烷结构的光谱抗生素。按照其来源可以分为两类：一种是天然四环素类，一种是半合成四环素类；其中天然四环素类是提取链丝菌属的培养液得到的，如金霉素（chlortetracy-cline，又名氯四环素）、土霉素（oxytetracycline，又名地霉素或氧四环素）、四环素(tetracycline）和地美环素（demeclocycline，又称去甲金霉素），其中四环素是由金霉素催化脱卤得到的。由于天然合成的四环素类抗生素结构不是很稳定，抗菌活性不强，因此对其进行结构改造得到的半合成四环素类，其中包括多西环素(doxycycline，又称脱氧土霉素、强力土霉素）、米诺环素（minocycline，又称二甲胺四环素或美满环素）和美他环素（metacycline，又称甲烯土霉素）等。上述七种抗生素是目前在临床和兽医上最常见的七种抗生素。

四环素类抗生素在化学结构上属于氢化并四苯环衍生物，因其结构中含有四个苯环而命名，其核心处为氢化并四苯环。四环素类的化学结构如图5-7所示。四环素类抗生素在近可见区（350nm附近）具有强紫外吸收。该类抗生素具有相似的理化性质，四环素类为黄色结晶性粉末，在甲醇、乙醇中的溶解度较大，而在乙酸乙酯、丙酮、乙腈等有机溶剂中的溶解度比较小。从结构图中可以看出C-4位的二甲氨基为碱性，而C-3,C-5,C-6,C-10,C-12,C-12a为酸性，主要是由于酚羟基和烯醇基的存在，因此，该类化合物是两性化合物。四环素类抗生素在干燥条件下性质比较稳定，但遇光后容易变色，目前用的比较多的为其盐酸盐形式。

四环素类化合物在酸性或者碱性条件下均易发生变性反应，如图5-8所示。在pH＜2的条件下易发生脱水反应，C-5a位的H与C-6位的羟基发生反式消除生成橙黄色化合物，此时的抑菌活性降低甚至消失；在pH=2～6时，C-4位的

图5-7四环素类抗生素基本结构

二甲氨基易发生差向异构化反应，生成4-β-二甲胺基异构体，反应过程中，一些阴离子（PO₄^3-、CH₃COO^-）的存在会加快异构化的进程，其中生成的差向异构体4-差向四环素，其活性不仅减弱，而且毒性是四环素的2～3倍，很容易引起中毒现象，因此各个国家均有相关文件对4-差向四环素的含量进行了不同程度的控制。在pH>9的情况下，四环素类抗生素发生开环，生成无效的内酚型异构体。另外，四环素类分子中的酚羟基与烯醇基还会与金属离子发生螯合反应，生成不溶性络合物。例如，与铁离子生成红色络合物，与钙离子、铝离子生成黄色络合物等，长期服用四环素类药物后，其能够与牙齿中的钙螯合，生成黄色钙络合物，使牙齿变黄，称为“四环素牙”，是临床上常见的一种副作用。

图5-8四环素类的变性反应机理

(1)四环素类抗生素的抑菌机制

四环素类抗生素是一种广谱抗生素，可作用于大多数革兰氏阳性和阴性菌，如肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌和部分葡萄球菌、破伤风杆菌、梭状芽胞杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌等，此时还能抑制立克次氏体、砂眼病毒及淋巴肉芽肿病毒等。四环素类抗生素能够抑菌最主要的原因是其每一个分子都包含一个线性熔合的四环素核。

四环素类抗生素的抑菌机制主要是该类化合物可以与细菌的核糖体30S亚基在A位产生特异性结合，破坏tRNA与RNA之间的密码子—反密码子反应，最终通过阻断氨酰-tRNA与细菌核糖体受体在A位点的结合，阻碍细菌蛋白合成时的肽链延长，从而抑制细菌蛋白的合成；同时，四环素分子还必须通过膜系统（革兰氏阳性菌和阴性菌的膜系统不相同）才能够与他们将要作用的靶位结合，从而达到有效的杀菌作用。因此，四环素的作用方式涉及与核糖体的结合以及跨膜运输两方面。

(2)四环素类抗生素的危害

四环素是动物疾病治疗的常用药，在畜禽养殖业主要将其用于细菌感染性疾病的预防和早期治疗，另外，还可作为饲料添加剂来促进动物生长。由于一些养殖者不遵循休药期规定，在加工过程中污染饲料，将四环素用于食品保鲜等原因，造成了动物源食品中的抗生素残留，给食用动物食品的人类带来严重的安全问题。其对人体的危害主要包括以下几点。

①耐药性是细菌最显著的危害，长期低剂量的使用四环素类药物是细菌产生耐药性的主要原因。近几年，四环素类药物的使用量逐渐增大，一些细菌己经由单纯的对一种药物有耐药性发展到对多种药物均具有耐药性。也有研究表明细菌的耐药性不仅仅局限在动物之间，其在动物与人之间也是能够相互传递的，这将对动物疫病防治以及人类的身体健康产生严重威胁。

②在环境方面，患病畜禽服用四环素类药物后，药物在体内会以原型或者代谢物的形式排出，滞留在环境中。大多数情况下，进入环境中的药物残留仍然具有活性，会进一步影响环境中的微生物、动物等。这些药物残留在多个环境因子的作用下会发生迁移，转化，富集等作用。

③过量使用四环素类抗生素会使对畜禽和人类产生影响，一般表现为慢性毒性作用。由于在动物源食品中，四环素类的残留量很低，不会表现为急性毒性作用，但是长期低剂量的摄入四环素类药物则会造成药物残留蓄积，产生器官病变，严重者则会导致变态反应。

④另外，长期使用四环素类药物还会产生其他影响，比如破坏人体肠道内的正常菌群，病原菌趁机大量繁殖，造成疾病的产生，影响动物体的正常生命活动；另外，还可能会引起双重污染。给疾病的治疗带来困难。

(3)我国四环素类抗生素的残留现状

目前，我国对动物源食品中兽药残留、激素残留的污染研究刚刚起步。临床上常用的四环素类药物有四环素、金霉素、土霉素，由于他们具有医动学特征和光谱的抗菌活性而被广泛使用，主要用于预防和治疗畜禽疾病。其中，四环素类药物中仅有金霉素能够作为饲料添加剂使用，但一些养殖者为了追求一时的经济利益，非法使用抗生素，长期过量使用抗生素造成药物在动物组织中的残留，不仅使耐药菌株的数量增加造成其他抗生素的使用受到限制；另一方面，造成药物在动物性食品中的含量超标，直接危害人类的身体健康。因此，对于动物源食品中抗生素残留的检测是研究的重点，因此，一些国家纷纷出台了土霉素、四环素、金霉素的限量标准，如表5-3所示。目前，国外对四环素类抗生素药物检测方法的研究比较多，其中有微生物法、酶联免疫检测法、液相色谱质谱联用法等，并且研究已经非常成熟。我国对此类药物的报道也不少，但是往往局限在单一组分中的测定。而且，我国动物组织中四环素类抗生素残留检测的国家标准和行业标准还不完善，在我国颁布实施的检测动物组织中关于四环素类抗生素残留的方法中，存在适应性差以及难以重复等特点，因此，建立并完善我国动物组织中抗生素的分析方法体系，并将其推广使用，进而保障消费者的日常生活健康，任重而道远。

表5-3部分国家和地区限量标准

从表5-3中可以看出，中国制订的国家限量标准在肌肉、肝脏、肾脏、牛奶、禽蛋等种类上的限量标准均小于或等于其他国家，说明我国在制订标准时均比较严格，主要原因是因为近年来，发达国家和地区制订兽药最高残留限量标准设置食品贸易性壁垒，使我国食品出口连连受阻，导致我国出口贸易损失严重，食品出口产值剧烈下降。为此，通过我国与国际食品法典委员会以及一些发达国家食品中兽药残留限量标准对比分析研究，从比较中发现差距，从而制订更加严格的国家限量标准，提高我国的食品安全。

(4)四环素类抗生素的检测

四环素类药物残留给动物及人类带来的危害不容忽视，其检测方法在世界范围内也备受关注。因此，精准分析检测兽药残留的组分对人类健康也有着重要的意义。四环素类抗生素残留检测的研究包括对样品的提取、净化以及对目标化合物进行分离检测两部分，其中，四环素类化合物的提取与净化是研究的重要环节，样品的提取、净化技术是否高效、快速的进行会影响样品分析方法的可靠性、准确性；而采用不同的检测技术对目标化合物进行分离检测是研究的关键。

①样品的提取与净化。由于测定的样品中成分复杂多样，在对四环素类抗生素残留量进行检测时干扰的物质较多，例如，样品中的高浓度的盐分以及存在的大分子蛋白质均会影响四环素类抗生素的色谱峰的峰形、保留时间、迁移时间等因素，因此，试样的提取和净化成为样品检测的重要环节，选择合适的方式进行提取和纯化显得尤为重要。

a．前处理。最大限度地达到以下两个要求：一方面，最大限度地提取目标化合物；另一方面，前处理过程还要最大限度地去除杂质．降低基质造成的千扰降低检测限等。目前，不同的四环素类抗生素的前处理方法有液-液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)、固相萃取（solid-phase extraction, SPE)、基质辅助固相分散萃取（matrix solid-phase dispersion，MSPD)、分子印迹技术(molecular imprinting technique, MIT)、限进介质（restricted access materials,RAM）等。

b．液-液萃取。该提取方法的原理是在两种互不相容的有机溶剂中，分析物的溶剂间分配系数不同。该方法不需要特别严格的实验条件，对设备的要求不高，常用的有机溶剂有乙酸乙酯、三氯乙酸或者不同种有机溶剂间的混合物。但是，采用该方法进行操作时耗时长、选择性低、溶剂消耗量大、不符合现代仪器分析的总体发展趋势，并且当有样品发生乳化现象时会影响测定的结果，因此，该方法已经逐步被固相萃取所取代。但近几年，已有学者提出一种新型微萃取技术液液分散微萃取（dispersive liquid-liquid micro-extraction，DLLME)，该法操作简单、准确度高、对环境的污染小，短短几年取得了较大的研究进展。

c．固相萃取。该方法的原理是固体吸附剂能够将目标物吸附，从而达到目标物与干扰物质的分离和富集。其主要操作步骤有样品前处理、活化上样、洗脱剂洗脱及回收待测物等。与液-液萃取相比，固相萃取使用的样品体积及溶剂量会减少，另外对分析物的选择性性较高不会发生乳化现象，它还能与其他仪器联用实现自动化。近几年，在固相萃取的基础上，磁性固相萃取技术出现主要是在吸附剂上做了优化，采用磁性或者可被磁化的物质作为吸附剂，该方法的比表面积更大，消耗的溶剂较少，能够实现低浓度的微量萃取，同时还具有平衡时间短，萃取效率高等。

d．基质辅助固相分散萃取。该萃取技术的原理是将样品首先与填料混合研磨，使样品均匀混合在固定相颗粒表面，成为半固态后装入柱中，然后根据“相似相溶”原理选择合适的淋洗剂洗脱出各种待测物。该方法的优点是它将匀浆、提取和净化多个步骤融为一体，有效地减少了样品的损失，另外，该方法适用于农药兽药的多残留分析，特别适用于一个或者单个化合物的分离，该方法也常用于液体或者黏稠样品，对于含脂量大的原料也非常适用，目前提出已有20多年的历史。

e．分子印迹技术。该方法的原理是将具有结构互补的功能化聚合物单体与模板分子目标化合物通过交联剂结合，然后用适宜溶剂将目标化合物洗脱出来，形成分子印记聚合物，该聚合物对目标化合物具有高特异性识别能力，能够高效识别目标化合物。但是，采用分子印迹技术时由于合成的分子印迹聚合物时需要大量的模板分子，给清除造成了一定的难度，所以会造成＜5％的模板分子残留。即使是1％的模板分子未被清除，这也将影响超微量成分的测定。

f．限进介质。该方法的原理是利用固定相表面疏水物质的排斥作用，限制基质复合物进入孔内，而小分子待测物则可以通过，这些小分子化合物则是通过疏水作用、离子作用、亲和作用下达到分离的目的。该方法具有净化样品完全、对目标分析物的选择性好等优点，可实现对复杂生物样品的分析。

②样品的检测方法。目前，复杂样品中四环素类抗生素的检测方法已经取得了很大进展，借助于灵敏度高的分析仪器，HPLC等大大拓宽了抗生素残留的分析范围，目前常用的抗生素残留分析方法有以下几种。

a．高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC)。该检测方法分离效果好、灵敏度高，但是由于四环素类化合物易于与反向硅胶柱上残留的硅醇类化合物产生不可逆吸附，容易导致色谱峰出现峰形拖尾现象。因此，可以使用扫尾剂来改善峰形，常用的扫尾剂有草酸、磷酸、柠檬酸、甲酸以及磷酸氢二钠等。同时还可以结合各种类型的检测器使用，例如，荧光检测器灵敏度高、选择性强，适用于痕量物质的分析。另外还有化学发光检测器，高效液相色谱-单重四级杆质谱检测器等广泛用于四环素类抗生素的检测。

b．毛细管电泳法（capillary electrophoresis, CE)。该方法将传统的电泳技术与现代柱分离方法有效地结合起来，是一种很好的定量分析方法，在样品量很小的时候具有灵敏度高护分辨率好、分析速度快、环境友好、样品使用量少，能够实现多物质同时检测等优点。该方法的原理是将缓冲溶液装入毛细管柱中，当在毛细管柱的两端加上一定的电压时，带电荷的溶质便会朝着与电荷极性相反的电极方向移动。由于各组分的浓度不同，所以他们的迁移速度也不相同，所以经过一段时间后，各个组分就会按照速度或者浓度的大小进行排序，依次到达检测器被检出，最终将会得到按时间分布的电流谱图。

c.酶联免疫分析法（the enzyme-linked immunoassay, ELISA)。该方法是基于酶标记的免疫分析方法，避免了同位素标记的放射性污染和标记物衰变等缺点，操作相对简单方便，具有灵敏度高、特异性强、分析通量大、快速安全可靠等优点，在农兽药残留分析中得到了较快的发展。该方法通常是以半抗原形式与大分子量载体形成人工抗原，通过免疫动物产生对其具有特异性的免疫活性物质－抗体，从而与抗原发生体外结合反应，达到检测待测物的目的。

d．微生物学检测法。目前公认的测定抗生素类药物的经典方法，也是中国药典使用的方法。该方法成本低、操作简单、但是容易受到其他抗生素的干扰，并且检测灵敏度低。主要是根据对抗生素敏感的实验菌在适当的条件下产生抑菌圈的大小及药物的浓度成比例来评价的。四环素类药物的检测方法还有电化学分析法、化学发光分析法以及温室鳞片分析法等。

目前，国内外关于四环素类抗生素残留的样品处理技术和检测方法已有很多，随着对四环素类抗生素应用研究的不断深入，特别是四环素类抗生素在保鲜、防腐等方面的应用，对四环素类抗生素残留的分析也将不断深化。