l．实验目的

1)了解液质联用仪的基本结构、主要功能及工作原理。

2)熟悉用于液质联用仪的离子源的类型并掌握电喷雾电离源及大气压化学电离源的区别及产生电离的类型。

3)掌握液相色谱-高分辨三级四极杆质谱联用仪的基本使用方法。

4)掌握基本的谱图解析知识。

2．实验仪器及主要性能参数

(1)仪器名称

菲尼根液相色谱-高分辨三级四极杆质谱联用仪（Finnigan TSQ Quantum LC/MS/MS Ultra AM,Thermo,USA),XCalibur数据处理系统。

(2)主要性能参数

质量范围：能够分析样品的原子（分子）质量范围，30～1500u;

扫描速度：2000u/s;

数据处理：数据采集速率达195 000个／s，高分辨核心；

扫描功能：全扫描、选择离子扫描、选择反应串联质谱扫描、子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描、反应监测扫描、混合扫描。

3．实验辅助设备及试剂

(1)辅助设备

离心机、循环水式真空泵、移液枪50uL和1000uL各一只、微量注射器250uL一只、离心管1ml若干只、滤水器、超声清洗器、振荡器。

(2)试剂

甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），重蒸水，甲酸，乙酸，氨水等（测试样品要求没有酸、碱、盐）；辅助气、鞘气：高纯氮气；碰撞气：氩气。

4．实验原理

液相色谱-质谱联用仪（LC-MS)主要包括液相色谱和质谱两部分。液相色谱由自动进样器、色谱柱、PDA（阵列二极管检测器）组成，利用混合物中各组分在色谱柱中的保留时间不同，达到对混合物逐个分离的目的。从液相色谱部分出来的各个组分随即进入质谱进行检测。质谱部分主要包括进样系统、离子源、质量分析器、检测器四部分。离子源的主要作用不仅是将待测样品分子离子化，而且还将离子化的样品分子汇聚成具有一定能量和形状的离子束。质量分析器的作用是利用电磁场（磁场、高频电场、磁场与电场组合、高频脉冲电场等），根据质荷比的不同，将来自离子源的离子束按空间位置、时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离。检测器的作用是接收、检测以及记录被分离后的离子信号。质量分析器根据离子质荷比大小的不同将其分离，检测系统接收信号并记录，最终得到完整的质谱图。

液质联用中最关键的技术问题是将溶液状态的被测物质离子化，即接口技术。迄今为止，大气压电离（API）接口技术是比较成熟的，主要由电喷雾电离（electros-pray ionization, EST）和大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization,AP-CI）两种方式组成。

LC MS联用技术凝结了液相色谱高分辨性与质谱高灵敏度和高专属性等优点，在药物代谢及药理分析、药物合成中微量杂质和降解产物的分析鉴定以及精细化学品的结构鉴定等领域发挥着不可替代的作用。

乙酰左卡尼汀（acetyl-L-carnitine）是一种天然存在的类维生素类物质，其主要功能是促进脂类代谢，临床上用来治疗和预防老年性痴呆。其结构式如365页图12-14所示。

在制备乙酰左卡尼汀过程中易产生杂质，本实验以乙酰左卡尼汀为例，利用液相色谱-质谱联用技术对在制备过程中产生的副产物进行分析鉴定。

5．实验步骤

(1）仪器工作状态检查

双击“Quantum Tune”图标打开工作界面，在快捷工具“Display Instrument Status”下面的“Vacuum'，栏里检查仪器运行状态，条件合格后进行后面的测试操作，其中最重要的几个参数应满足：前级泵压力在0.9～2.OTorr范围内，离子规压力＜5.0×10^-6 Torr，分子涡轮泵的速率为750 Hz或749 Hz、温度≤46℃、功率＜80W。

（2)直接进样测定操作

1)样品准备：称取1 mg左右的待测样品，配制成1～10 ug/mL的溶液（溶剂可采用甲醇、乙腈或异丙醇），用250uL进样器吸取约200 uL试样溶液后装入质谱仪注射泵，连接好进样管路。

2）测试条件设置：打开“Compound Optimization Workspace”，菜单窗口，单击“Define Scan”，快捷按钮，在“Optimize Compound Dependent Devices”对话框里分别设置下列参数：电喷雾电压设为4000V（正离子）或3000V（负离子），鞘气压力设为5～10psi，离子吹扫气压力和辅助气压力均设为0，离子传输毛细管温度设为270℃，毛细管直流偏电压和透镜偏离电压以仪器自动赋值为准。

3)一级质谱全扫描：打开注射泵开始进样（流量设置为5.0uL/min)，切换到“Instrument Method Development Workspace”窗口，在“Full Scan”对话框里选中Q1 MS或Q3MS，根据目标质量数值选择扫描的质量数范围，单击“Apply”按钮，然后在“Acquire Data”对话框里输入数据的名称和存放位置，单击“Start”按钮开始采集数据。

4）二级质谱扫描：切换“MS/MS”，对话框，选中“Product”，在“Parent Mass”栏里输入目标质量数值，单击“Apply”按钮，开始采集目标分子的二级质谱图。

5）数据处理：单击“Acquire Data”对话框里的“Stop”按钮，停止采集数据，接着停止进样和质谱扫描，然后单击“View”按钮切换到数据处理窗口，选择输出总离子流色谱图、一级全扫描质谱图和二级质谱图。

(3) LC进样分析操作

在软件“Xcalibur”主页面下进行操作。

1)样品准备：称取待测样品不超过lmg，配制成0.01～0.1ug/mL的溶液（溶液可采用甲醇、乙腈或异丙醇），装入样品瓶后放进自动进样器，记下样品瓶的位置。

2)仪器工作状态检查：打开“Xcalibur”主页面，在主页面左边的栏目里查看各系统的工作状态，确保各系统处于“Ready to Download”,“Xcalibur”状态。

3)测试方法建立：单击“Instrument Setup”图标进入系统设置页面，首先打开“Surveyor LC Pump”，窗口，在“General”标签各栏目里输入各溶剂的名称及所在位置、对色谱柱进行有关说明，然后切换到“Gradient Program”标签，对梯度洗脱的条件进行设置；接着转换到“TSQ Quantum”窗口，对质谱测试条件进行设置；最后切换到“Surveyor PDA”窗口，在“Run Length"栏输入与梯度洗脱相同的时间值，在“Spectra”栏里，将扫描范围设置成200～800nm，扫描波长递增率设为5 nm，然后根据情况在“Channels”栏选择1～3个波长进行扫描检测；保存上述设定的测试条件，即为下面进行检测的方法。

4)样品分析与测试。单击“Sequence Setup”图标进入进样程序设置页面，分别在“Sample Type”（样品类型)、“File Name”（数据结果名称）、“Sample ID”（样品编号）、“Path”（数据结果保存路径）、“Inst. Meth”（采用的测试方法）和“Position”（样品瓶在自动进样器中的位置编号）等栏目下设置好参数，单击“Run Sample”决捷按钮，进样检测。

5)数据处理系统：分析检测完毕，切换到数据处理窗口，调出保存的数据结果，选择输出PDA色谱图和相应的质谱图。

6．实验数据处理

显示并打印总离子流色谱图、待测组分的一级质谱图和每个组分的二级质谱图，并对每个组分峰的质谱图进行分析。乙酰左卡尼汀粗品的总离子流色谱图如图12-20所示。

图12-2。乙酰左卡尼汀粗品的总离子流色谱图

保留时间为9.82min的色谱峰的ES1⁺-MS图如图12-21所示，主要的准分子离子峰为204。其二级质谱图如图12-22所示。

图12-21色谱峰（tR=9.82)对应的一级质谱图

图12-22准分子离子峰204的二级质谱图

分析准分子离子峰204的二级质谱图，主要产生m/z 145,85和60三个碎片离子峰。经分析其为目标产物乙酰左卡尼汀。
分析液质联用图时发现，在保留时间为14.47 min时，出现明显的一个副产物，其一级质谱图如图12-23所示，准分子离子峰145的二级质谱如图12-24所示。

图12-23色谱峰（tR=14.47)对应的一级质谱图

图12-24准分子离子峰145的二级质谱图

分析准分子离子峰145的二级质谱图，主要产生m/z 85、57和43三个碎片离子峰。经分析其可能结构为

7．注意事项

1)溶解样品尽量避免使用DMF,DMSO,DCSO等黏性比较大的溶剂，否则溶剂峰不容易清洗，影响以后测试效果。

2)开检测器之前先要检查仪器状态，状态正常时可以开，否则要对问题进行排查，直至状态正常才可以进行测试。