硫代葡萄糖苷( 简称硫苷) 是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产物，主要分布于植物的根、茎和叶中。当植物细胞受到破坏( 如挤压、虫咬等) 后，硫苷与植物内生的黑芥子酶接触，降解产生异硫氰酸酯、恶唑烷酮和硫氰酸酯等化合物［1］，其中异硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且对人畜无害。因此硫苷及其降解产物的研究引起了科学工作者的浓厚兴趣。根据侧链R 基团的不同，目前已发现约120 种硫苷，其中有多种具有抗癌、抗肿瘤、杀菌和杀虫活性的异硫氰酸酯，如吴华等［2］比较几种异硫氰酸酯的杀线虫活性，发现烯丙基和丙烯酰基异硫氰酸酯具有良好的杀线虫活性。大量研究表明甲硫基己基异硫氰酸酯等具有良好的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的抗癌药物［3–6］。硫苷的检测方法主要是传统的化学方法和现代的仪器分析手段。化学方法耗时、误差大、操作繁琐，只能测定硫苷总量。液相色谱法具有很高的分离效率，但对于硫苷单体鉴别需要对照品，无法满足快速鉴别硫苷的需要。笔者采用超高效液相色谱–离子阱– 飞行时间质谱联用技术，既能高效分离硫苷，又能准确、快速鉴别硫苷。对于硫苷及降解产物的研究具有重要意义，同时又能够提高工作效率。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱– 离子阱– 飞行时间质谱仪：LCMS–IT–TOF 型，日本岛津公司；数显恒温水浴锅：HH–6 型，常州澳华仪器有限公司；真空干燥箱：VD23 型，德国BINDER 公司；电子天平：AUY220 型，日本岛津公司；超声波清洗器：KS–120EI 型，宁波海曙科生超声设备有限公司；旋转蒸发仪：R–216 型，瑞士BUCHI 公司；台式高速离心机：H–1650 型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；研磨机：A11 基本型，德国IKA 公司；白芥种子：产地为湖北武汉；正己烷、氯仿、乙酸铵、甲酸：分析纯，广州化学试剂厂；甲醇：色谱纯，美国Fisher 公司；实验用水为美国Pall 公司Purelab Ultra 超纯水系统制备的超纯水，电阻率为18.2 MΩ · cm。

1.2硫代葡萄糖苷提取［7–8］

白芥种子在105℃干燥3 h，以灭活黑芥子酶保护硫苷。干燥种子经粉碎后，过420 μm 筛。称取粗粉约50 g 于锥形瓶中，依次用正己烷50 mL，氯仿50 mL 各3 次除脂。残渣经真空干燥，用300 mL沸腾的70% 甲醇水溶液浸泡，超声提取30 min，连续2 次，合并提取液，静置至室温。提取液经离心分离，将清液真空下浓缩至原体积的20%。取1 mL浓缩液经石墨化碳脱色，滤液供超高效液相色谱–串联质谱分析。

1.3流动相配制

用电子天平准确称量乙酸铵0.385 g，置于1 L量瓶中，加入1 mL 甲酸，用水溶解定容后，经0.22μm 微膜过滤，超声波脱气后使用。

1.4液质联用分析条件

（1）UPLC 条件

ODS C18 柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，日本岛津公司) ；柱温：30℃；流动相A ：5 mmol／L 乙酸铵–1‰甲酸溶液；流动相B ：甲醇；流动相流速：0.2 mL／min ；进样体积：20 μL ；梯度洗脱：0～3min，98% A ；3～25 min，98%～20% A ；25～30 min，20%～20 % A ；30～35 min，20%～98% A。

（2）MS 条件

ESI 负离子模式；电压：–3.5 kV ；雾化气：N2，流量为1.5 L／min ；干燥气压力：100 kPa ；碰撞气：Ar ；检测器电压：1.7 kV ；Heat Block 温度：200℃；CDL 温度：200℃；一级质谱扫描范围：m／z300～700 ；母离子扫描范围：m／z 315～650 ；二级质谱扫描范围：m／z 50～700 ；离子累积时间：10 ms ；CID 碰撞能量：100% ；碰撞气能量：100%。

2结果与讨论

2.1分析条件选择

硫苷在水溶液中是亲水性阴离子化合物，在反相色谱柱中，保留时间短。优化实验发现，在ODS–C18 柱上采用流动相A(5 mmol／L 的乙酸铵+0.1%甲酸) 和流动相B( 甲醇) 能够很好分离，并且有很好的质谱响应。质谱Heat Block 和CDL 温度采用200℃，温度过高会造成硫苷裂解，过低则影响离子化和脱溶剂化效果。为获得比较丰富的二级离子碎片信息，CID 碰撞能量和碰撞气能量均采用100%。

2.2分析结果

按照1.4 分析条件检测白芥种子提取液，获取硫苷提取离子流色谱图及其一、二级质谱图( 见图1～图11)。根据裂解机理，并参考文献［9–12］，共鉴定出5 种硫苷，结果见表1。

2.3质谱碎片离子裂解机理

二级质谱特征离子，对于鉴别硫苷具有重要意义。在MS2 中，母离子先后失去SO3(80 Da) 和C6H10O5(162 Da) 后产生242 Da 中性分子丢失，氢重排后出现相对应的R—C(SH)=N—O— 离子。另一裂解途径是硫苷上的氢发生重排后，失去C6H11O5(163 Da) 和C6H12O5S(196 Da) 中性碎片。与此同时，二级质谱中还能观察到m／z 195，241，259，275，291 的特征离子，这些离子是由于硫与相邻碳原子发生断裂，并伴有氢重排形成的。硫代葡萄糖苷负离子模式下主要特征二级碎片离子裂解机理见图12［13–14］。

3结语

利用液相色谱– 串联质谱技术快速、高效、准确的分离与鉴定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，对硫代葡萄糖苷二级质谱80，162，163，196，242 Da 中性分子丢失和m／z 195，241，259，275，291 特征离子裂解机理进行了阐述和总结，能够准确推测硫代葡萄糖苷化学结构，对于十字花科植物的开发与利用具有重要意义。