一.细菌分类方法

1970年Colwell提出将表型与系统进化学分类的优点结合的分类方法，称为多相分类学（polyphasic taxonomy)，其含义是将所有可以获得的表型、基因型和化学信息整合在一起，建立普遍适用于所有细菌的分类方案，目前与此目的相适应的分类方法包括表型特征分类法、遗传学分类法及生化分类等方法。

a、表型特征分类法

1．传统分类法19世纪以来，以细菌的形态、生理特征为依据的分类法奠定了传统分类法的基础。细菌分类鉴定的主要依据是其表型(phenotype)特征，即形态、染色、培养、细胞壁结构、生理生化、抗原性以及对噬菌体的敏感性等特征。这些表型特征对细菌的鉴定和分类具有很重要的作用，尤其是在临床微生物学的实践中，至今仍有应用价值。例如沙门菌（Salmonella spp.）与大肠埃希菌（E.colt)按表型特征分为两个属，二者的16S rRNA序列同源性约90％，按照目前的考虑，它们应归于同一个属，但是二者表型的区别对临床诊断十分重要，已被微生物学家所熟悉，因此，几乎没有人赞同改变它们按表型确定的分类地位。依据细菌的形态、培养特性可将细菌划分到科、属，再依据生理生化特性可将细菌划分到种。另外，依据细菌的抗原性和噬菌体的敏感性进一步将细菌划分到型。

2．数值分类法及自动细菌鉴定法20世纪60年代，随着计算机的应用而将数值分类引入了细菌分类，一般选用50项以上的细菌生理、生化指标，借助计算机分析各菌间的相似度，以此来划分种和属。在此基础上建立了细菌的自动化分类鉴定系统。多种商品化的半自动及全自动鉴定系统已广泛应用于细菌分类及临床鉴定，逐步实现了细菌分类鉴定的快速、方便和标准化。

b、遗传学分类法

目前微生物学界普遍考虑的分类依据是细菌的种系发生关系（phylogenetic relationship)，即分析其基因特性，从而确定分类地位。研究细菌的种系发生关系主要采用三种方法：测定DNA碱基（G+C）比例、核酸分子杂交以及rRNA寡核苷酸分析。

1. DNA的G+C的摩尔分数 除RNA病毒以外，各种生物都具有遗传物质DNA，其DNA的鸟嘌呤(G）和胞嘧啶(C）的摩尔分数是恒定的。微生物也一样，亲缘关系密切、表型高度相似的微生物往往有相似的G+C的摩尔分数。但是G+C的摩尔分数只反映DNA中碱基所占的百分数，并不表明序列，因此，不同种的细菌也可能有相近的G+C的摩尔分数。但是，可以肯定的是G+C的摩尔分数不同的细菌决不会属于同一种。一般认为，此项差异超过5％时，就不可能属于同一种；相差超过10％时，则为不同的属。

DNA中G+C的摩尔分数的测定可用化学或物理学方法，不同方法所得的结果可有差异。目前多用物理解链法。

熔解温度（melting temperature,Tm）法又称解链法，是将DNA样本缓缓加热，随着碱基对间氢键的断裂，DNA在260 nm处的吸光度值增加，出现约30％的增色效应。出现增色效应一半时的温度，被称为Tm。Tm与DNA的G+C的摩尔分数呈线性相关，Tm值愈高，DNA的G+C的摩尔分数值也愈高。测得DNA的Tm值后，可按Marmur等提出的公式计算DNA的G+C的摩尔分数。该公式为

Tm=69.3+0.41（G+C）

2．核酸分子杂交（hybridization of nucleic acids）其原理是将待检菌的DNA变性，其双链解为单链，而后与标记的参考菌株的单链DNA或rRNA杂交，按照碱基互补配对的原理，形成杂交DNA-DNA或DNA-rRNA。两种细菌DNA中共同的核苷酸序列愈多，杂交的互补区就愈多，二者的同源性就愈高，亲缘关系就愈近。DNA-DNA的同源性通常以％表示，一般认为，同源性在60％～70％以上者属同一种，同源性不到50％者为不同种。

由于核糖体RNA(rRNA)基因具有高度保守性，因此，DNA-rRNA杂交的同源性比DNA-DNA杂交的同源性更能表示二者的亲缘关系。

3. rRNA寡核苷酸分析rRNA寡核苷酸碱基序列（oligonucleotide catalog）是原核和真核细胞中最稳定的序列，1970年由美国科学家C.R.Woese等提出，迄今为止已用此方法对数百物种进行了广泛测定。由于rRNA寡核苷酸碱基序列变化比DNA慢得多，也稳定得多，故此被称为细胞中的“活化石”。

细菌中含有三种rRNA序列，分别为23S,16S和5S。现在的方法主要基于分析比较细菌菌株的16S rRNA寡核苷酸序列，据此确定其分类地位。之所以选择16S rRNA,是因为16S rRNA的核苷酸数目适中、信息量大，具有高度稳定性、易于提取和分析。分析方法多用指纹图谱法“finger print)：用一种RNA酶水解rRNA后，可产生一系列寡核苷酸片段，分析这些片段形成的电泳图谱，两株细菌的亲缘关系越近，其产生的寡核苷酸片段序列也越相近，图谱也越相似，从而确定种系的发生关系。

二.细菌分类系统

目前公认的细菌分类体系是二伯杰氏（Bergey）分类系统，细菌分类系统专著《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）是一本有代表性的、参考价值极高、比较全面系统的细菌分类手册。自1923年第1版问世以来，每隔4～5年修订一次，至1994年已出版至第9版。1984-1989年，国际上300多位细菌分类学家合作编写、陆续出版了《伯杰氏系统细菌学手册》第1版（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)，共4卷。并于2004年出版了第2版《伯杰氏系统细菌学手册》，本版包括5册，共30篇，收集了400。余种模式菌株的16S rRNA序列，力求细菌分类学模式(taxonomic model）和种系发育模式（phylogenetic model）的一致性。五册主要分类如下。

第一册为古细菌、蓝绿藻菌、光合作用菌和分支菌属。

第二册为变形菌门（Proteobacteria)。

第三册为G+C值低的革兰阳性菌。

第四册为G+C值高的革兰阳性菌。

第五册为浮霉菌门（Planctomycetes) ,螺旋体门（Spirochaetes )、纤维杆菌门(Fibrobacters)、拟杆菌属（Bacteroides)、梭杆菌门（Fusobacteria)。

《伯杰氏系统细菌学手册》虽然采纳了种系发生的分子生物学内容，但主要仍是依据经典的分类手段，未能充分体现分子序列研究对细菌分类的影响。Balows等编著的“原核生物”(The Prokaryotes）第2版（1992)，可弥补该手册的不足，该书有4卷4000页，650幅插图，得到了微生物学界的高度重视。另外，临床上也有采用CDC系统分类，该系统由美国疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）使用核酸杂交和核酸序列分析结果编排。