透射电镜样品制备方法

样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：

倒掉固定液，用0.1M，pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；

倒掉固定液，用0.1M，pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min；

用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；

用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；

纯包埋剂处理样品过夜；

将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在透射电镜中观察。

TEM样品包埋块制作有关注意事项

一、取材：

1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；

2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；

3、组织块大小：一般要小于1mm3。

二、固定：

固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。

1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中

2、使用锇酸的注意事项

（1）通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。

（2）锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。

三、漂洗：

应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。

四、脱水：

脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。

脱水过程中应注意：

（1）逐级脱水而不能急剧脱水；

（2）更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；

（3）脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。

五、渗透

渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。

包埋剂配制及使用过程中的注意事项：

（1）所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；

（2）配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；

（3）配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。23-10-20